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    蔗糖、硼酸、Ca2+對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響

    2021-05-06 13:06:53王波周蘭英夏華梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:萌發(fā)花粉培養(yǎng)基

    王波 周蘭英 夏華梅

    摘要:探究大白杜鵑花粉萌發(fā)所需的營養(yǎng)液濃度組合,為大白杜鵑的資源保存及雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。以大白杜鵑新鮮花粉為試驗(yàn)材料,利用單因子試驗(yàn)比較固體培養(yǎng)基中不同濃度的蔗糖、硼酸、Ca2+對其萌發(fā)的影響,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn),探討大白杜鵑花粉萌發(fā)的最佳蔗糖、硼酸、Ca2+濃度組合。結(jié)果表明,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),蔗糖、硼酸、Ca2+對大白杜鵑花粉萌發(fā)均起到促進(jìn)作用,但是超過一定質(zhì)量濃度時則起抑制作用,最適濃度分別為10%、0005%、0.002%。蔗糖、硼酸和Ca2+這3個因素的綜合作用對大白杜鵑花粉萌發(fā)有顯著影響,大白杜鵑花粉的最適培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%Ca2+。

    關(guān)鍵詞:大白杜鵑;花粉;萌發(fā);培養(yǎng)基

    大白杜鵑(Rhododendron decorum Franch.),別稱大白花杜鵑,是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron L.)木本植物,在我國主要分布在四川、云南、貴州、西藏等地,在四川省會理縣生長于龍肘山海拔1 900~2 100 m處,種群成片分布。大白杜鵑花簇多花,形如繡球,色澤艷麗;是杜鵑花中少有的香花品種,具有很高的觀賞價值;分布廣泛、海拔較低,是香花育種的理想親本。張敬麗等研究發(fā)現(xiàn),馬纓花(Rhododendron delavayi Franch.)與大白花杜鵑進(jìn)行雜交后,雜交種能夠結(jié)出可育的種子[1]。此外,大白杜鵑還可供食用和藥用[2-3],開發(fā)利用前景廣闊。但是,人為干預(yù)使其生境遭到嚴(yán)重破壞,資源日趨受到威脅,環(huán)境干旱使野生杜鵑結(jié)實(shí)率降低[4],大白杜鵑物種資源的保存迫在眉睫。

    目前,國內(nèi)外對大白杜鵑的研究主要集中在生態(tài)分布、染色質(zhì)組成[5]、營養(yǎng)成分[2]和組織培養(yǎng)[6]等方面,有關(guān)大白杜鵑花粉的儲存及其生活力、萌發(fā)條件的研究未見報道。目前已有少數(shù)其他杜鵑種花粉的研究,如徐芬芬等對毛杜鵑(Rhododendron pulchrum)花粉離體萌發(fā)特性的研究發(fā)現(xiàn),毛杜鵑花粉萌發(fā)的最適硼酸質(zhì)量濃度為10 mg/L,培養(yǎng)7 h后花粉萌發(fā)情況穩(wěn)定[7]。李玉萍等以滿山紅、映山紅、馬銀花、錦繡杜鵑的新鮮花粉為試驗(yàn)材料,測定不同液體培養(yǎng)基和儲藏方法下的花粉萌發(fā)力,發(fā)現(xiàn)杜鵑花花粉的適宜培養(yǎng)基配方為100 g/L蔗糖+20 mg/L 硼酸+20 mg/L CaCl2[8]。目前,關(guān)于其他植物花粉萌發(fā)的研究非常多,不同植物花粉萌發(fā)要求的最適培養(yǎng)基組合和濃度不同,但適量的蔗糖、硼酸、CaCl2會提高多數(shù)植物花粉的萌發(fā)率。目前,關(guān)于大白杜鵑花粉萌發(fā)的研究未見報道,本試驗(yàn)用蔗糖、硼酸及CaCl2 3個因素組成的固體培養(yǎng)基研究大白杜鵑花粉的萌發(fā)力,旨在找出適合大白杜鵑花粉萌發(fā)的營養(yǎng)液濃度組合,為大白杜鵑的資源保存及雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究所用材料于2013年5月9日采自四川省會理縣龍肘山海拔1 900~2 100 m處。選擇20株盛花期大白杜鵑植株上即將開放的100朵花,用濕毛巾包裹后放入裝有冰塊的潔凈紙盒內(nèi)冷藏并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,任其花藥自然開裂,收集花粉,并將花粉充分混勻,避免個體植株花藥不同引起的花粉生活力差異。將收集的花粉裝入花粉瓶中,于 4 ℃ 低溫冷藏。

    1.2 培養(yǎng)基配方和制作方法

    單因素試驗(yàn)中各因素濃度水平[9-10]如表1所示,以同樣濃度的空白培養(yǎng)基作為對照。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)后,總結(jié)分析各因素濃度對花粉萌發(fā)的影響,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行L16(43)正交試驗(yàn)。按濃度配方配制100 mL溶液,加入搪瓷碗中,煮沸后向其中加入1 g瓊脂粉,攪拌至充分溶解,冷卻后作為花粉接種用固體培養(yǎng)基。

    1.3 花粉培養(yǎng)觀測方法

    在雙孔凹型玻片孔內(nèi)滴1滴清水以保持濕度,在蓋玻片上滴入適量培養(yǎng)基,將花粉均勻播種在培養(yǎng)基上,再將有培養(yǎng)基的一面朝下蓋在玻片孔上,每個培養(yǎng)基設(shè)5個重復(fù)。將玻片放入25 ℃人工培養(yǎng)箱中,在黑暗條件下培養(yǎng)。每隔2 h觀測1次,發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)后,每隔1 h觀測1次,最終從2次測定萌發(fā)率基本相同開始測定萌發(fā)率。大白杜鵑花粉為四合體,單?;ǚ蹫閳A球形[11-12],在統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)時,只要有1個花粉萌發(fā)即視為萌發(fā),以花粉管長度超過花粉直徑作為判斷萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。每個玻片觀察5個視野,每個視野觀察的花粉數(shù)不少于30粒,記錄花粉的萌發(fā)數(shù)量,花粉萌發(fā)率的計算公式如下:

    花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/測定的花粉??倲?shù)×100%。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,并用SPSS軟件對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因變量多因素方差分析,若差異顯著,則在方差分析的基礎(chǔ)上用新復(fù)極差法(SSR)進(jìn)行因素水平間的多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大白杜鵑花粉萌發(fā)的基本情況

    將大白杜鵑花粉于25 ℃黑暗條件下處理3 h后,四合體吸水膨大,極面觀為三裂球形;6 h后花粉管從寬大的萌發(fā)溝內(nèi)長出,并逐漸增長;10 h后萌發(fā)基本趨于穩(wěn)定,花粉管的長度達(dá)到最長。在按試驗(yàn)對照條件處理12 h后,花粉的萌發(fā)效果見圖1。

    2.2 單因素試驗(yàn)中不同濃度蔗糖、硼酸、CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響

    2.2.1 蔗糖對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖2可知,不同濃度蔗糖對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當(dāng)蔗糖濃度為0、2%、5%、10%時,花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的升高而提高,分別為688%、20.77%、54.91%、74.23%,最大萌發(fā)率為74.23%;但當(dāng)蔗糖濃度超過10%以后,花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增加而下降。綜上,大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜蔗糖濃度為10%。

    2.2.2 硼酸對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖3可知,不同濃度硼酸對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當(dāng)硼酸濃度為0~0.005%時,花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的升高而提高,最大萌發(fā)率為5757%;但當(dāng)硼酸濃度超過0.005%以后,花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的增加而下降。綜上,大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜硼酸濃度為0.005%。

    2.2.3 CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)的影響 由圖4可知,不同濃度CaCl2對大白杜鵑花粉萌發(fā)有不同程度的影響。當(dāng)CaCl2濃度為0~0.002%時,花粉萌發(fā)率隨著CaCl2濃度的升高而提高,最大萌發(fā)率為39.47%; 但當(dāng)CaCl2濃度超過0.002%以后, 花粉萌發(fā)率隨著CaCl2濃度的增加而下降。綜上,大白杜鵑花粉萌發(fā)的適宜CaCl2濃度為0.002%,并且高濃度的CaCl2會明顯抑制大白杜鵑的花粉萌發(fā)。

    2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

    單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,對照條件下大白杜鵑花粉有少量萌發(fā),表明外源因素不是萌發(fā)的必要因素。如表2所示,大白杜鵑花粉在10%蔗糖+0005%硼酸+0.001%CaCl2培養(yǎng)基配方下的萌發(fā)率最高,達(dá)到86.69%。極差分析結(jié)果顯示,對花粉萌發(fā)率影響的因素排序?yàn)檎崽?、硼酸、CaCl2,極差依次為167.74、135.26、58.06,相應(yīng)的較優(yōu)水平分別為A3(10%)、B3(0.005%)、C2(0.002%),由較優(yōu)水平組合而成的最佳培養(yǎng)基配方為10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2,與單因素試驗(yàn)得出的正交試驗(yàn)結(jié)果最高的萌發(fā)率培養(yǎng)基配方一致。正交試驗(yàn)結(jié)果表明,蔗糖、硼酸和CaCl2在一定濃度范圍內(nèi)共同作用時對大白杜鵑花粉的萌發(fā)有一定促進(jìn)作用;大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方為10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%CaCl2。

    3 結(jié)論與討論

    很多研究發(fā)現(xiàn),植物花粉離體萌發(fā)的影響因素很多,內(nèi)因包括供體植株基因型、發(fā)育時期、花粉生活力等,外因如培養(yǎng)基固液形態(tài)、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度和濕度、光照條件、培養(yǎng)基營養(yǎng)種類和濃度等[13],其中蔗糖、硼酸及一些礦質(zhì)元素如外源Ca2+等的參與是比較重要的,是誘導(dǎo)離體花粉萌發(fā)的基本條件。在本試驗(yàn)中,對照處理的花粉也具有一定的萌發(fā)率,由此或可大膽推測,花粉可能本身就含有少量蔗糖、硼酸及Ca2+。目前已知,細(xì)胞壁是植物細(xì)胞最大的鈣庫,用X射線分析鈣在花粉粒中的分布結(jié)果也顯示,多數(shù)植物花粉壁上含有少量鈣[14]。

    一般認(rèn)為,蔗糖在花粉萌發(fā)過程中的作用有2個,一是為花粉萌發(fā)和花粉管的生長提供能源和碳源,二是調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境滲透壓[15-16]。試驗(yàn)中一定濃度的蔗糖促進(jìn)大白杜鵑花粉萌發(fā),最適宜的蔗糖濃度為10%,當(dāng)蔗糖濃度過高時,花粉萌發(fā)率開始下降,這與徐芬芬等的研究結(jié)果[17]相似。這有可能是因?yàn)檫m當(dāng)濃度的蔗糖能維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡,而過高的蔗糖濃度則會導(dǎo)致花粉管破裂產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象,從而造成原生質(zhì)體脫水,抑制花粉萌發(fā)生長,降低萌發(fā)率[18-19]。

    目前許多研究發(fā)現(xiàn),硼作為植物必需的微量元素,在花粉萌發(fā)和花粉管伸長中的主要作用是增加糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝,以增強(qiáng)花粉管壁的可塑性[20]。在離體條件下,補(bǔ)充一定量的外源硼,可以大大提高其花粉萌發(fā)率。在本試驗(yàn)中,提高硼酸濃度顯著提高了花粉萌發(fā)率,當(dāng)硼酸濃度為0.005%時,大白杜鵑花粉的萌發(fā)率最高。

    鈣離子在生物體的電化學(xué)震蕩理論中被稱為細(xì)胞中調(diào)節(jié)的“第二信使”,鈣離子水平受到環(huán)境中鈣含量和植物自身鈣受體的影響,從而引起一系列生長發(fā)育過程。在花粉的離體培養(yǎng)過程中,Ca2+可以通過多種途徑影響花粉萌發(fā)和花粉管的生長,其中涉及細(xì)胞骨架的組裝、分泌小泡的運(yùn)輸和融合、花粉管頂端的脈沖式生長、花粉管生長方向調(diào)控等各個方面[21-24]。許多研究發(fā)現(xiàn),外源鈣對花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用取決于細(xì)胞內(nèi)游離鈣的含量,即在細(xì)胞內(nèi)游離鈣充足或已充分吸收外源鈣時,外源鈣對花粉萌發(fā)和花粉管生長就可能起抑制作用,反之則起促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中單因素Ca2+濃度明顯影響大白杜鵑花粉萌發(fā),表明一定程度的外源鈣能促進(jìn)大白杜鵑花粉萌發(fā)和花粉管生長,當(dāng)Ca2+濃度為0.002%時,花粉萌發(fā)率最高,而當(dāng)Ca2+濃度高于0.005%時,花粉萌發(fā)則明顯受到抑制,這與周瑞金等的研究結(jié)果[25]一致。

    通過正交試驗(yàn),得到大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方是10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002% CaCl2,在此條件下花粉萌發(fā)率最高,且遠(yuǎn)超過單因素試驗(yàn)中的最高萌發(fā)率。另外,當(dāng)鈣離子為高水平而硼酸為低水平,或鈣離子為低水平而硼酸為高水平時,兩者表現(xiàn)出負(fù)交互作用。原因可能是單因素之間的交互作用促進(jìn)了花粉萌發(fā),如硼酸可以與蔗糖形成絡(luò)合物,從而促進(jìn)果膠物質(zhì)的合成、糖的吸收,進(jìn)而更大程度地促進(jìn)花粉萌發(fā)[15]。此外,硼還可能通過影響關(guān)鍵酶活性與Ca2+濃度梯度相關(guān)聯(lián),影響其花粉管細(xì)胞壁的構(gòu)建與生長[26]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,蔗糖對花粉萌發(fā)影響最大,硼酸次之,Ca2+對花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用,但影響比硼酸小。鈣離子對花粉萌發(fā)的影響較硼酸小的結(jié)論得到了其他研究者的支持,一般認(rèn)為花粉細(xì)胞內(nèi)鈣離子較多而硼素較少,因而萌發(fā)時胞外硼素的影響較胞外鈣離子的影響高[27]。

    通過花期噴施具有促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長的物質(zhì)的方法來提高結(jié)實(shí)率和促進(jìn)種子發(fā)育、膨大是生產(chǎn)上的一項(xiàng)重要措施。本研究結(jié)果表明,大白杜鵑花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基組合10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2可為大白杜鵑雜交育種提供技術(shù)上的參考。在花期噴灑蔗糖、硼酸、CaCl2或者其三者組合有助于大白杜鵑結(jié)實(shí),而在授粉過程中噴灑含有蔗糖、硼酸、CaCl2的花粉營養(yǎng)液的方法是輔助授粉的較好手段。但在實(shí)際生產(chǎn)中,由于營養(yǎng)液對花粉萌發(fā)的作用可能還與樹齡和溫度等其他因素有關(guān),因此營養(yǎng)液的適宜濃度應(yīng)根據(jù)環(huán)境條件經(jīng)試驗(yàn)而定。

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