綠豆根腐病病原菌分離和致病力鑒定

閆強(qiáng) 丁佩 張勤雪

摘要：從采集自我國6個?。ㄊ校┚哂懈Y狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株，進(jìn)一步通過離體葉片接種檢測獲得54株致病菌株。通過形態(tài)學(xué)和保守序列分析共鑒定出14種致病病原菌，其中尖孢鐮刀菌檢出率最高，首次檢測出群結(jié)腐霉可以侵染綠豆并引起根腐癥狀。對來自國內(nèi)外12個綠豆品種進(jìn)行群結(jié)腐霉接種試驗，結(jié)果表明，群結(jié)腐霉對不同綠豆品種均表現(xiàn)出強(qiáng)致病力，病情指數(shù)在45～96之間;進(jìn)一步分析表明，皖綠2號對群結(jié)腐霉表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的抗性水平。

關(guān)鍵詞：綠豆;根腐病;病原菌分離;群結(jié)腐霉;抗病性;致病力

綠豆由于其生育期短、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，在用地養(yǎng)地及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要作用。同時綠豆是我國傳統(tǒng)的雜糧作物，因其經(jīng)濟(jì)利用價值高，屬高蛋白、低脂肪、中淀粉、醫(yī)食同源作物，是人們理想的營養(yǎng)保健食品。2016年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《全國種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整規(guī)劃（2016—2020）》為我國雜糧小品種發(fā)展成為大產(chǎn)業(yè)、帶動農(nóng)民增收指明了方向。2017年的“中央一號”文件也明確提出，增加我國雜糧等優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品供給。在政策導(dǎo)向、種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及人們飲食觀念改變的影響下，綠豆種植面積也在逐年增加，目前，我國綠豆常年種植面積超過66.67萬hm2（http：//www.moa.gov.cn/）。隨著我國綠豆種植面積的擴(kuò)大、重茬和迎茬，綠豆病蟲害也隨之逐漸加劇，進(jìn)而嚴(yán)重影響了綠豆產(chǎn)量和品質(zhì)。

綠豆生育期主要病害有苗期的根腐病，花莢期的枯萎病、葉斑病、病毒病、白粉病等。其中綠豆根腐病是一種由多種病原菌混合感染引起的土傳病害，病害發(fā)生在種子萌發(fā)后整個生育階段[1-2]。2014—2015年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在黑龍江西部地區(qū)綠豆種植區(qū)根腐病發(fā)病普遍[3]，給綠豆生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害。

本研究利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對綠豆根腐病致病菌進(jìn)行分離、鑒定，以期為后續(xù)研究該病害的發(fā)生規(guī)律、制定綜合防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集和病原菌分離純化

2019年7—9月，在國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究人員幫助下，分別從位于河北省石家莊市、黑龍江省齊齊哈爾市、重慶市潼南縣、遼寧省沈陽市、河南省南陽市和內(nèi)蒙古呼和浩特市的綠豆種植田塊采集植株矮小，莖基部表現(xiàn)細(xì)縮，出現(xiàn)水漬、腐爛癥狀、褐色病斑的發(fā)病植株。

田間采集到的新鮮病株用自來水沖洗干凈，并用手術(shù)刀在莖基部的病健交界處切取大小約 0.5 cm×0.5 cm的組織小塊。組織樣本放入70%乙醇中處理30 s進(jìn)行表面消毒，然后移入2%次氯酸鈉溶液中處理10 min，最后以滅菌水沖洗5～7遍并用滅菌濾紙吸干組織表面水分。處理好的組織放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，然后在溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待有菌落長出取邊緣菌絲純化2次后接種于PDA培養(yǎng)基斜面上保存。

1.2 致病性測定

從生長3周的綠豆蘇綠1號植株上選取生長狀態(tài)一致的三出復(fù)葉，切下后正面朝上置于保濕托盤中，葉柄處用濕潤脫脂棉球包裹用于保濕。葉片中心位置區(qū)域用0.05%吐溫溶液處理，消除葉片表面張力，用滅菌水沖洗后再用1mL注射器在處理區(qū)域中心位置針刺創(chuàng)傷。從培養(yǎng)4 d的菌落邊緣切取大小約4 mm×4 mm的菌絲塊，貼在上述葉片創(chuàng)傷處。每個分離菌株接種10張葉片。接種完畢后用保鮮膜密封保濕，置于溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次葉片發(fā)病狀況。待接種葉片發(fā)病后，根據(jù)柯赫氏法則（Koch postulates）對病原菌進(jìn)行再分離。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，記錄菌落顏色和形態(tài)特征并拍照。挑取邊緣菌絲制作臨時切片，在光學(xué)顯微鏡（Olympus CX41）下觀察病原菌形態(tài)特征，結(jié)合菌落在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)和顏色特征，參照《真菌鑒定手冊》判定病原菌種類。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

從培養(yǎng)7 d的PDA平板表面刮取病原菌菌絲，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取病原菌總DNA[4]。分別采用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4，β-tubulin（TUBUF2_F/TUBUF1_R），Histone 3（H3-1a/H3-1b），EF1α（EF1-728F/EF1-986R）（表1）對病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小正確后送南京擎科生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast同源比對，與已報道病原菌的核酸序列進(jìn)行比較，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果確定病原菌種類。

1.5 群結(jié)腐霉菌接種物制備

分離得到的群結(jié)腐霉菌（Pythium myriotylum）菌株CQ19-1（PmCQ19-1）首先在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)4 d。接種體制備參照Kirkpatrick等的方法略加改動：從邊緣切取約1 cm×1 cm大小的菌絲塊，放置10個菌絲塊到含有滅菌細(xì)沙-玉米粉培養(yǎng)基（200 mL細(xì)沙，11.2 mL玉米粉，80 mL滅菌水）的500 mL三角瓶中，然后置于溫度為25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，期間每天搖勻培養(yǎng)基以保證菌絲在培養(yǎng)基中分布均勻。收集培養(yǎng)物與蛭石按1 ∶ 4體積比混勻作為接種物備用[5]。

1.6 群結(jié)腐霉菌接種

綠豆接種參照Kirkpatrick等的方法：取250 mL一次性塑料杯底部打孔排水，裝入約150 mL蛭石，然后平鋪厚度為1 cm（約40 mL）的群結(jié)腐霉菌培養(yǎng)物[5-6]。挑選籽粒飽滿的綠豆種子每盆放置10粒于菌絲培養(yǎng)物表面，然后覆蓋50 mL蛭石。未培養(yǎng)菌絲的細(xì)沙-玉米粉培養(yǎng)基按同樣比例混合后作為空白對照，每個品種接種3盆。澆水至蛭石飽和后，放置于25 ℃、16 h—8 h光照—黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)期間及時澆水保證蛭石處于水分飽和狀態(tài)。

1.7 不同綠豆品種對群結(jié)腐霉菌的抗性評價

抗病表型數(shù)據(jù)記錄采用以下方案：分別于播種后7、14 d統(tǒng)計植株存活率;并于14 d小心拔出植株，用自來水沖洗干凈根部蛭石，記錄不同綠豆品種的發(fā)病等級。發(fā)病分級按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計：（1）整個根系生長健康，無發(fā)病癥狀;（2）側(cè)根可見輕微腐爛癥狀，1%～20%的根系組織表現(xiàn)出癥狀;（3）側(cè)根腐爛癥狀明顯，同時主根開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，21%～75%的根系組織表現(xiàn)出癥狀;（4）主根及側(cè)根均出現(xiàn)明顯腐爛癥狀，76%～100%的根系組織腐爛;（5）種子腐爛不萌發(fā)[6]。病情指數(shù)按以下公式計算：

病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病株數(shù)×發(fā)病等級數(shù)值）/（植株總數(shù)×最高發(fā)病等級數(shù)值）×100。

不同品種間抗病水平差異顯著性分析采用Fisher氏最小顯著差數(shù)檢驗（LSD）法進(jìn)行多重比較，顯著水平以P<0.05為基準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣采集和病原菌分離

從來自6個?。ㄊ校┚哂懈Y狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株（表2、圖1）。其中河北省石家莊市5株、黑龍江省齊齊哈爾市22株、重慶市潼南縣18株、遼寧省沈陽市14株、河南河南陽市6株、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市8株。

2.2 病原菌致病性檢測和形態(tài)學(xué)特征

將分離得到的菌株分別接種綠豆離體葉片后，有54株分離物接種的葉片表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。不同致病菌侵染綠豆葉片后病斑表型和侵染時間表現(xiàn)出明顯差異，發(fā)病癥狀出現(xiàn)在接種后1～6 d，其中分離物CQ19-01C和HNS19-02在侵染24 h后即出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，侵染菌絲塊附近葉片出現(xiàn)明顯的水漬狀腐爛;而LN19-04a和LN19-04d在接種6 d后出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀（圖2）。收集發(fā)病組織樣本對病原菌進(jìn)行再分離，均獲得與接種分離物菌落形態(tài)一致的培養(yǎng)物，即完成柯赫氏法則（KochsPostulates）致病性檢測。

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落形態(tài)也表現(xiàn)出差異（圖3）。其中檢出率最高的1種病原菌生長狀態(tài)如下：氣生菌絲濃密，絨狀，初期菌絲白色，后期菌落背面殘生淺紫色至深紫色色素（HLJ19-03b和NMGS19-02）。培養(yǎng)7 d后的菌落多產(chǎn)生小型分生孢子，卵圓或腎形，大小為（7～26）μm（平均值為12.0 μm）×（2～6）μm（平均值為4.2 μm），可初步判定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和另外3個基因保守區(qū)段序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果表明，54株致病菌共包含14種病原微生物。其中有16株是尖孢鐮刀菌，主要檢出地為齊齊哈爾市（7株）、呼和浩特市（5株）、南陽市（4株）;10株是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），主要檢出地為齊齊哈爾市（4株）、石家莊市（3株）和南陽市（3株）;其次是群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）（4株），檢出地為潼南縣（2株）、南陽市（2株）;此外還從齊齊哈爾市檢出4株木賊鐮刀菌（F. equiseti）（表3）。

從地域分布來看，在沈陽市的發(fā)病樣本分離到樹棲交鏈孢菌（Alternaria arborescens）、細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）、茄病鐮刀菌（F. solani）、螺旋木霉（Trichoderma spirale）和玉蜀黍絲核菌（Waitea circinata）等5種病原菌。在齊齊哈爾市的樣本中分離到厚孢鐮孢菌（F. chlamydosporum）、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌（F. proliferatum）等4種鐮刀菌和1種立枯絲核菌共5種病原菌。從來自南陽市的樣本中分離到立枯絲核菌、群結(jié)腐霉、尖孢鐮刀菌和Fusarium neocosmosporiellum共4種病原菌。從來自潼南縣的樣本中分離出菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）、群結(jié)腐霉菌等3種致病菌。從來自呼和浩特市和石家莊市的樣本中分別檢出尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌（表3）。

2.4 群結(jié)腐霉形態(tài)學(xué)特征觀察

分析鑒定結(jié)果和侵染試驗結(jié)果表明，群結(jié)腐霉為首次報道能夠侵染綠豆;同時對綠豆具有強(qiáng)致病性，接種離體葉片24 h后即出現(xiàn)明顯壞死斑，因此對該病原菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。在PDA培養(yǎng)基上生長7 d后，群結(jié)腐霉菌絲發(fā)達(dá)，呈棉絮狀，分枝，菌絲直徑為3～11 μm（平均值為7.2 μm）;孢子囊頂生或間生寬度為9～18 μm（平均值為13 μm）;藏卵器球形或近球形，直徑為23～35 μm（平均值為29.4 μm）;游動孢子腎形，雙鞭毛（圖4）。

2.5 不同綠豆品種對群結(jié)腐霉抗病性評價

為了進(jìn)一步評價群結(jié)腐霉對不同綠豆品種的致病性并為后期抗源篩選提供參考，選擇了來自11個不同省份和1個巴基斯坦的共12個綠豆品種進(jìn)行抗性評價。播種后7、14 d存活率的統(tǒng)計結(jié)果表明，不同品種間存在明顯的抗性差異。蘇綠3號在2個調(diào)查時間點(diǎn)的存活率僅有13%、20%，而皖綠2號存活率分別為90%、93%，同時冀綠7號也表現(xiàn)出較高的存活率。病情指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果與存活率

趨勢基本一致，12個品種的病情指數(shù)在45～96之間。皖綠2號在所檢測品種中表現(xiàn)出最強(qiáng)抗性，病情指數(shù)為45，顯著低于其他品種。需要注意的是，在所選擇的12個品種中，僅有皖綠2號的病情指數(shù)在50以下，其中有5個品種的病情指數(shù)都在90以上（圖5至圖7）。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對采集自我國6個省（市）的根腐癥狀綠豆病株進(jìn)行病原菌分離，結(jié)合進(jìn)一步致病性檢測獲得了54株致病菌株，形態(tài)學(xué)和保守序列分析結(jié)果表明，其屬于14種病原微生物。目前，關(guān)于綠豆根部病害的研究相對于其他大宗作物還較落后，而抗病資源和基因的挖掘則研究更少。孫菲菲對多個省份綠豆3種主要土傳病害的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，其中也分離鑒定到大量尖孢鐮刀菌菌株[7]。本研究的結(jié)果與此類似，54株中有16株是尖孢鐮刀菌，此外還有另外13株分離物屬于鐮刀菌屬。本研究對每個地區(qū)采集樣本的分離病原菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)沈陽市和齊齊哈爾市檢出病原菌種類最多，而呼和浩特市和石家莊市均只檢出1種病原菌，這些信息為綠豆種植者有針對性地進(jìn)行病害防治提供了相關(guān)參考。

此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)群結(jié)腐霉可以侵染綠豆并具有強(qiáng)致病性。群結(jié)腐霉隸屬于卵菌綱腐霉屬，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，其中許多種類是重要的土傳植物病原菌，常造成果實腐爛、根腐、莖基腐和幼苗猝倒病等多種作物病害[8]。群結(jié)腐霉作為一種土傳植物病原菌，可造成菜豆出苗前爛種和幼苗根腐[9];其引起的花生腐霉菌果腐病在一般發(fā)病田可造成產(chǎn)量損失達(dá)15%左右，重病田可致絕收[10];在黃姜上引起的莖基腐病造成的減產(chǎn)在 5%～30%之間[11];其引發(fā)的芋頭根腐病可造成 80%～100%的產(chǎn)量損失[12]。相關(guān)研究表明，在淹水和高濕的大豆田塊中，腐霉菌是最主要的土傳病原菌[5]。本研究對12份國內(nèi)外綠豆品種抗性評價的結(jié)果也顯示，群結(jié)腐霉對綠豆具有很強(qiáng)的致病性，僅有皖綠2號的病情指數(shù)在50以下，其中有5個品種的病情指數(shù)在90以上。因此在我國南方或雨水較多的年份應(yīng)該注意田間排水并采取積極措施，防止群結(jié)腐霉的危害。

目前，對作物根腐病主要通過應(yīng)用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，然而對群結(jié)腐霉等卵菌來講，它們不同于真菌，常見的真菌殺菌劑對其作用有限，作為土傳病原菌，在濕潤條件下使用化學(xué)藥劑較為困難，成本昂貴，而且長期使用殺菌劑會造成土壤污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性、以及危害其他土壤有益生物[13]。因此，利用植物遺傳抗性仍然是控制根腐病的一種有效方式。本研究對綠豆的群結(jié)腐霉抗性評價方法和指標(biāo)進(jìn)行了積極探索，為后續(xù)的抗病資源篩選積累了理論基礎(chǔ)。

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