結(jié)核分枝桿菌甲硫氨酰tRNA合成酶與底物及其類似物的結(jié)合比較

王 煒，任偉宏，陳明心，蔣 露，張 岱，陳 磊

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases, aaRS)是一類細(xì)胞內(nèi)高度保守蛋白酶家族，參與到生命遺傳信息翻譯過程中，是確保細(xì)胞遺傳信息正確翻譯的酶。不同物種來源的MetRS具有結(jié)構(gòu)上的多樣性，適合特異性抑制劑的篩選，已被證明是理想的抗生素作用靶點(diǎn)[1]。在近幾年的aaRS抑制劑研究中，發(fā)現(xiàn)的一些氨酰tRNA合成酶抑制劑，具有高選擇性和強(qiáng)抑制能力。AN3016是一種亮氨酰tRNA合成酶抑制劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，其抑制結(jié)核分枝桿菌的能力強(qiáng)于異煙肼[2]。

結(jié)核分枝桿菌MetRS(MycobacteriumtuberculosisMethionyl-tRNA synthetase, MtMetRS)的研究始于上個(gè)世紀(jì)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其氨?；磻?yīng)后就沒有新的研究報(bào)道。MtMetRS研究進(jìn)展緩慢的原因與其重組蛋白制備困難有關(guān)[3]。由于MetRS抑制劑存在專一性強(qiáng)、抗菌譜覆蓋面窄的問題。為了篩選結(jié)核分枝桿菌MetRS的抑制劑，首先需要大量獲得MtMetRS。我們通過構(gòu)建不同重組質(zhì)粒，進(jìn)行重組蛋白表達(dá)篩選，最終解決了MtMetRS重組蛋白制備問題，為抑制劑的篩選提供基礎(chǔ)條件。此外，我們使用Thermal Shift Assay(TSA)驗(yàn)證了重組MtMetRS與底物及其類似物的結(jié)合能力，為抑制劑的選擇提供方向。

1 材料與方法

1.1材料 pET32a、pQE60、pGEX-6P-1、pTrcHisB質(zhì)粒、M15大腸桿菌、BL21大腸桿菌本實(shí)驗(yàn)室保存。高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。引物及基因合成、測(cè)序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。青霉素、IPTG購(gòu)自索萊寶公司。Milipure超濾管購(gòu)自默克公司。HisPur Ni-NTA樹脂、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Thermo Scientific。ATP、Met、ADO、AMP-PNP、Sypro Orange購(gòu)自Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1MetRS序列分析 氨基酸序列決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。為了分析人MetRS和結(jié)核分枝桿菌MetRS的差異，選用GenBank登錄號(hào)為AAH15011.1、AAH09115.1、WP_003911321.1氨基酸序列為分析對(duì)象。氨基酸序列以FASTA格式整理為一個(gè)文件。使用MEGA軟件中的MUSCLE[4]Neighbor-Joining算法對(duì)MetRS氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。以比對(duì)好的文件和人胞質(zhì)MetRS晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：5GL7)為材料，使用ESPript網(wǎng)絡(luò)服務(wù)制作基于結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)圖，并指示出參與底物結(jié)合的氨基酸殘基。

1.2.2重組基因的表達(dá)篩選 根據(jù)GenBank登錄號(hào)CP003248.2核酸序列，由公司合成MtMetRS基因序列并插入到pET32a的NcoI、XhoI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列之間。通過PCR引物設(shè)計(jì)，在MtMetRS基因的兩端加入相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切及T4連接酶鏈接，MtMetRS基因連接到pQE60、pGEX-6P-1、pTrcHisB載體上。使用菌落PCR鑒定陽性克隆后送公司測(cè)序確認(rèn)MtMetRS基因開放讀碼框是否正確。pQE60-MtMetRS重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子為T5啟動(dòng)子，使用M15宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。pET32a-MtMetRS的T7啟動(dòng)子、pGEX-6P-1-MtMetRS的tac啟動(dòng)子、pTrcHisB-MtMetRS的trc啟動(dòng)子可以在BL21宿主菌中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。pQE60-MtMetRS/M15、pET32a-MtMetRS/BL21、pGEX-6P-1-MtMetRS/BL21、pTrcHisB-MtMetRS/BL21，在18 ℃、250 r/min、1 mM IPTG條件下過夜誘導(dǎo)重組MtMetRS表達(dá)。誘導(dǎo)后4 ℃離心收集細(xì)菌，菌泥重懸到500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0裂解緩沖液中。菌液超聲裂解后，15 000 g離心45 min去除未破碎的細(xì)菌及不溶性顆粒，可溶性部分用Ni-NTA樹脂結(jié)合。首先用20 mL裂解緩沖液洗滌樹脂，然后用15 mL含25 mmol/L咪唑的相同緩沖液洗滌。最后，用10 mL含300 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫樹脂結(jié)合的蛋白。分別取裂解液和Ni-NTA樹脂洗脫液加入4×蛋白上樣緩沖液，90 ℃加熱10 min后用SDS-PAGE分析。

1.2.3重組MtMetRS的制備 通過表達(dá)篩選，確定使用pQE60-MtMetRS質(zhì)粒制備重組MtMetRS。使用上面相同的條件誘導(dǎo)表達(dá)2 L菌液，經(jīng)超聲破碎、高速離心、Ni-NTA樹脂結(jié)合與洗脫后，使用截留分子量為50 kDa的Milipure超濾管濃縮洗脫液至1.5 mL。濃縮液注入kta層析儀中，使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0緩沖液進(jìn)行色譜分離。收集洗脫峰樣品，使用Milipure超濾管濃縮。濃縮蛋白經(jīng)Nanodrop調(diào)整濃度為10 mg/mL。50 μL分裝后經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2.4MtMetRS與配體的結(jié)合分析 使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0緩沖液稀釋Sypro Orange到10×。重組MtMetRS蛋白稀釋到20 μmol/L濃度后與5 mmol/L濃度的ATP、Met、AMP-PNP、ADO、Met+ATP、Met+ADO、Met+AMP-PNP按照1∶1體積比混合，在冰上孵育15 min，然后與10× Sypro Orange按照1∶1體積比混合后冰上孵育15 min。在Bio-Rad CFX實(shí)時(shí)定量PCR儀上設(shè)置程序：溫度范圍20～80 ℃，從20 ℃起始，溫度每升高0.5 ℃，撫育1 min，使用Cal Gold540通道檢測(cè)Sypro Orange熒光信號(hào)。

2 結(jié) 果

2.1多序列比對(duì)結(jié)果 MetRS的氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示，紅色五星指示出參與結(jié)合中間產(chǎn)物MetAde的氨基酸殘基。MetRS雖然催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但這些氨基酸殘基在人MetRS和結(jié)核分枝桿菌MetRS中并不完全一致。這個(gè)差異提示不同MetRS結(jié)合相同化合物的能力可能存在差異。而這種差異是設(shè)計(jì)篩選特異性、低毒性MetRS抑制劑的前提。

圖1 MetRS的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of MetRS

2.2重組基因載體的構(gòu)建 針對(duì)pQE60、pGEX-6P-1、pTrcHisB載體多克隆位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列設(shè)計(jì)MtMetRS基因引物。以pET32a-MtMetRS質(zhì)粒為模板擴(kuò)增MtMetRS基因。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，在1 500 bp marker旁有一條帶，與MtMetRS基因大小近似。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化后連接入相應(yīng)載體中。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證讀碼框完全正確。

M: The product of MtMetRS gene amplification；1: GeneRuler 1 kb Marker圖2 MtMetRS基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Result of MtMetRS gene amplification

2.3重組載體的表達(dá)篩選 為獲得可溶性重組蛋白，在重組質(zhì)粒表達(dá)篩選時(shí)我們只驗(yàn)證細(xì)菌裂解液上清是否可以純化到重組蛋白。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導(dǎo)表達(dá)500 mL菌液，經(jīng)超聲裂解后使用Ni-NTA樹脂純化。分別取細(xì)菌裂解液和Ni-NTA樹脂洗脫液，使用SDS-PAGE分析。電泳結(jié)果如圖3所示，第3、5泳道分別是pQE60-MtMetRS、pTrcHisB-MtMetRS質(zhì)粒表達(dá)純化的重組蛋白，與55 kDa蛋白marker位于同一水平。1、7泳道分別是pET32a-MtMetRS、pGEX-6P-1-MtMetRS質(zhì)粒表達(dá)純化的重組蛋白。2、4、6、8泳道分別為pET32a-MtMetRS/BL21、pQE60-MtMetRS/M15、pTrcHisB-MtMetRS/BL21、pGEX-6P-1-MtMetRS/BL21誘導(dǎo)表達(dá)后的裂解液。由于pTrcHisB-MtMetRS質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白氨基端含有一個(gè)短的標(biāo)簽。為避免重組蛋白氨基端多余多肽對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響，我們最終選擇pQE60-MtMetRS質(zhì)粒作為重組蛋白MtMetRS的生產(chǎn)質(zhì)粒。

M：Protein marker；1：Recombinant MtMetRS expressed by pET32a-MtMetRS/BL21；2：Lysis solution of pET32a-MtMetRS/BL21 induced by IPTG；3：Recombinant MtMetRS expressed by pQE60-MtMetRS/M15；4:Lysis solution of pQE60-MtMetRS/M15 induced by IPTG；5: Recombinant MtMetRS expressed by pTrcHisB-MtMetRS;6: Lysis solution of pQE60-MtMetRS/M15 induced by IPTG；7: Recombinant MtMetRS expressed by pGEX-6P-1-MtMetRS/BL21;8: Lysis solution of pGEX-6P-1-MtMetRS/BL21 induced by IPTG圖3 重組蛋白的表達(dá)篩選Fig.3 Expression screening of recombinant protein

2.4MtMetRS重組蛋白的制備 pQE60-MtMetRS/M15接種到2 L LB培養(yǎng)中，18 ℃ 0.5 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)表達(dá)。重組MtMetRS的分子排阻層析結(jié)果如圖4所示。MtMetRS的洗脫峰成對(duì)稱圖形，提示重組蛋白的結(jié)構(gòu)均一。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量及洗脫峰值計(jì)算獲得的方程式為Y=7.900 35-0.186 09X。重組MtMetRS的洗脫峰體積為16.86 mL，依據(jù)上述方程計(jì)算出分子排阻層析測(cè)量的重組蛋白分子量為57.93 kDa，與MtMetRS的理論分子量59.12 kDa近似。使用Nanodrop的測(cè)定值除以重組蛋白的消光系數(shù)1.371，調(diào)整蛋白質(zhì)的濃度為10 mg/mL，50 μL液氮速凍后-80 ℃保存。

圖4 重組MtMetRS及標(biāo)準(zhǔn)品的gel filtration洗脫峰Fig.4 Gel filtration elution peaks of recombinant MtMetRS and standard

圖5 重組MtMetRS的TSA分析Fig.5 TSA to assess ligand:MtMetRS binding

為了進(jìn)一步分析TSA的結(jié)果，我們?cè)趫D6中展示了利什曼原蟲及恥垢分枝桿菌MetRS與底物結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。從圖6A中可以看到Met結(jié)合區(qū)是一個(gè)疏水口袋，其通過疏水區(qū)域的大小和疏水特性識(shí)別和結(jié)合Met[3]。Met的這種結(jié)合方式對(duì)提高M(jìn)etRS的熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)有限。而MetRS與ADO和Met結(jié)合時(shí)，不能引起催化口袋的封閉，催化口袋處于開放狀態(tài)，如圖6A所示。只有MetRS與Met和ATP結(jié)合后，催化形成的MetAde和PPi可以引起催化loop的構(gòu)象變化，封閉催化口袋，如圖6B所示。形成封閉的催化口袋可能是MtMetRS熱穩(wěn)定性提高的基礎(chǔ)。

A: MetRS combined with Met and ADO(PDB：2X1L)；B: MetRS combined with MetAde and PPi(PDB：3KFL)圖6 MetRS與配體結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)Fig.6 Molecular structure of MetRS and ligand binding

3 討 論

人們已經(jīng)從天然來源或通過篩選合成文庫(kù)方法鑒定到了許多aaRS抑制劑[5-7]。甲硫氨酰tRNA合成酶與其他aaRS最大的區(qū)別是不同物種來源的MetRS顯示了結(jié)構(gòu)的多樣性[8]。人們?cè)缇驼J(rèn)識(shí)到MetRS作為藥物靶標(biāo)的重要性，并不斷在MetRS抑制劑的研究中取得進(jìn)展[9-16]。上個(gè)世紀(jì)90年代人們已經(jīng)意識(shí)到MtMetRS在抗結(jié)核分支桿菌抑制劑研究中的重要性，初步報(bào)道了MtMetRS的部分生化參數(shù)[17]。但由于MtMetRS重組制備方法沒有突破，此后再?zèng)]有MtMetRS的研究報(bào)道。Ingvarsson等對(duì)MtMetRS晶體學(xué)的研究也是由于難以大量獲得重組MtMetRS而改為使用恥垢分枝桿菌MetRS為研究對(duì)像。

影響重組基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的因素有密碼子頻率、蛋白質(zhì)表達(dá)速度、目的蛋白的溶解性、mRNA結(jié)構(gòu)等。在之前的MetRS研究報(bào)道中均使用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白，因此我們認(rèn)為密碼子頻率和蛋白的溶解性不是阻礙獲得重組MtMetRS的主要原因。pTrcHisB-MtMetRS質(zhì)粒在插入基因的5′端存在一個(gè)小的順反子結(jié)構(gòu)，可以改善質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的mRNA 5′端結(jié)構(gòu)，有利于mRNA與核糖體的結(jié)合，但是在表達(dá)篩選結(jié)果中沒有看出其明顯增加重組蛋白的表達(dá)。使用弱啟動(dòng)子降低蛋白質(zhì)表達(dá)速度可能是獲得重組MtMetRS的主要原因。

MetRS分子具有底物誘導(dǎo)的構(gòu)象變化。在未結(jié)合底物時(shí)，催化口袋呈現(xiàn)開放狀態(tài)，而結(jié)合底物后催化口袋封閉。以往針對(duì)MetRS抑制劑的設(shè)計(jì)和篩選以開放狀態(tài)為對(duì)象，選擇化合物配體去結(jié)合催化口袋。我們的TSA分析結(jié)果和利什曼原蟲與MetAde結(jié)合模型顯示其催化口袋的封閉狀態(tài)對(duì)配體結(jié)合最強(qiáng)。這提示結(jié)合MetRS并促使其催化口袋封閉的化合物是很好的抑制劑。以往以MetRS催化口袋的開放狀態(tài)為目標(biāo)設(shè)計(jì)、篩選抑制劑可能不是最優(yōu)的方法。

總而言之，我們建立了重組MtMetRS的制備方法，為研究和篩選結(jié)核分枝桿菌抑制劑提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，TSA結(jié)果更進(jìn)一步為抗結(jié)核分枝桿菌抗生素的研究指明方向。

利益沖突：無