響應(yīng)面法優(yōu)化云南核桃分心木多酚提取工藝

李 瑞 梁永林 闞 歡 劉 云

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233）

核桃（Juglans regia）分心木，別名胡桃隔，胡桃?jiàn)A，胡桃衣，是胡桃科（Jualandaceae）核桃屬（Juglans）植物核桃果仁之間的干燥木質(zhì)隔膜，一般占核桃質(zhì)量的4%～5%，核桃分心木呈片狀，體輕薄脆且易折斷，一般呈棕色或淺棕褐色[1-2]。中國(guó)素被稱為核桃之鄉(xiāng)，其核桃主產(chǎn)于我國(guó)華北、西北、西南等地，因此，核桃分心木的產(chǎn)量也尤為豐富，其中云南當(dāng)屬全國(guó)第1[3-4]。核桃分心木史載于《山西中藥志》[5]，其功效后續(xù)在《中草藥大辭典》[6]《本草再新》[7]中均有收載，中醫(yī)認(rèn)為核桃分心木具有健脾、固腎、利尿、澀精、降熱促眠、止帶、止瀉止痢等功效，常作為中藥的輔藥之一[8-9]。核桃分心木中主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類、皂苷類、甾體類、內(nèi)脂、香豆素等多種化學(xué)成分，根據(jù)相關(guān)研究表明，核桃分心木的水提液或醇提液均具有一定的抗菌效果，并對(duì)小鼠的腎陽(yáng)虛病癥具有改善的作用，并且所含有的黃酮及皂苷類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[1,10-12]。核桃分心木提取物是近年核桃副產(chǎn)物研究的主要方向，提取物中含有一定量的多酚成分，多酚作為天然的植物次生代謝產(chǎn)物，是能潛在促進(jìn)健康的一種化合物，目前核桃分心木化合物組成成分的分析報(bào)道較多，但針對(duì)核桃分心木單類物質(zhì)的研究尚少，尤其是多酚成分，缺乏全面性，系統(tǒng)性分析[13-15]。在應(yīng)用方面，分心木的衍生產(chǎn)品也僅有分心木速溶茶粉研究，分心木袋泡茶的研制，染色劑輔料，知其基礎(chǔ)效用卻未能在單一成分上有所建樹(shù)，在綜合性研究分析上也有所欠缺[16-19]。云南作為核桃大省，核桃產(chǎn)量頗高，為改善核桃大多只食其“果”卻棄其“木”并造成大量核桃分心木資源浪費(fèi)的現(xiàn)狀，需要對(duì)云南核桃分心木進(jìn)行有效的研究分析[20-21]。本研究采用云南核桃分心木作為此次試驗(yàn)材料，以復(fù)合酶輔助進(jìn)行云南核桃分心木多酚的水提工藝研究，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝，并以不同濃度乙醇對(duì)提取液進(jìn)行初步的洗脫純化研究。多酚對(duì)于云南核桃分心木的研究具有重要意義，能為云南核桃分心木的開(kāi)發(fā)利用奠定科學(xué)理論依據(jù)，逐步帶動(dòng)云南核桃副產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)效益及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，具有針對(duì)性對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，實(shí)現(xiàn)云南核桃分心木的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃分心木由云南磨漿農(nóng)業(yè)股份有限公司提供。AB?8大孔樹(shù)脂，F(xiàn)olin?Ciocalteu顯色試劑，果膠酶（來(lái)源：黑曲霉（Aspergillus niger），叢梗孢科（Moniliaceae）曲霉屬（Aspergillus）；酶活力為5萬(wàn)U/g；最適pH為3.5～4；最適溫度為50 ℃），纖維素酶（來(lái)源：木霉（Trichodermaspp.），肉座菌科（Hypocreaceae）木霉屬（Tricho derma）；酶活力為10萬(wàn)U/g；最適pH為4.8；最適溫度50 ℃），沒(méi)食子酸（＞99%），無(wú)水乙醇（99.7%），無(wú)水碳酸鈉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.025 g沒(méi)食子酸，加水定容到500 mL，配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的沒(méi)食子酸樣品溶液，按體積梯度分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL于50 mL容量瓶中，加入1 mL Folin?Ciocalteu顯色試劑，混合 搖勻 靜置反 應(yīng)5 min，再 加入2 mL濃 度為10%的Na2CO3，加水定容配制成沒(méi)食子酸樣品待測(cè)溶液，搖勻靜置，室溫條件避光反應(yīng)1 h，通過(guò)UV?2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津，日本）在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。所得結(jié)果以吸光值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)求得回歸方程，添加趨勢(shì)線繪制出沒(méi)食子酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。

圖 1 沒(méi)食子標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallon standard curve

1.2.2 云南核桃分心木中多酚的提取與測(cè)定

取適量云南核桃分心木于YB?250A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市速峰工貿(mào)有限公司，中國(guó)）中破碎為細(xì)顆粒，過(guò)60目篩，篩上物密封干燥保存用于多酚成分提取試驗(yàn)研究。準(zhǔn)確稱取云南核桃分心木樣品1 g，按比例加入蒸餾水，并添加復(fù)合酶（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1）輔助提取，在50 ℃的DZKW?4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，中國(guó)）中提取80 min，冷卻后經(jīng)萬(wàn)用電爐（上海坤天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國(guó)）加熱煮沸30 s進(jìn)行高溫滅酶活，再次冷卻后使用KH20R?Ⅱ臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）以4 500 r/min高速離心15 min，使用SHZ?DⅢ循環(huán)水式多用真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司，中國(guó)）進(jìn)行抽濾，采用Folin?Ciocalteu法測(cè)定云南核桃分心木中的多酚，取1 mL澄清液于50 mL容量瓶中，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法對(duì)云南核桃分心木澄清液中總多酚的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)[22]。多酚提取量按公式（1）計(jì)算。

式中：C為測(cè)量樣品液總酚濃度，V為提取液的體積，N為稀釋倍數(shù)，W為樣品的質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

云南核桃分心木多酚單因素的研究是基于溶劑浸提理論，確定影響云南核桃分心木多酚提取條件的主要因素有提取溫度、復(fù)合酶添加量、液料比，通過(guò)對(duì)單個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，其他影響因素固定不變，分別測(cè)定云南核桃分心木提取液中多酚的質(zhì)量濃度來(lái)確定各因素的最佳提取條件。選擇液料比（A，80、90、100、110、120 mL/g）、復(fù)合酶添加量（B，0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）、水浴溫度（C，20、30、40、50、60 ℃）這3個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，分別考察分析這3個(gè)因素對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響。

1.2.4 多酚提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box?Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)云南核桃分心木多酚提取量進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化云南核桃分心木多酚提取工藝，評(píng)價(jià)指標(biāo)為多酚提取量，其中自變量分別以?1、0、1對(duì)試驗(yàn)水平進(jìn)行編碼，編碼水平見(jiàn)表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)水平因素Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 多酚洗脫純化試驗(yàn)

將工藝優(yōu)化后的云南核桃分心木多酚提取液通過(guò)RV3V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（艾卡儀，德國(guó)）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，通過(guò)AB?8大孔樹(shù)脂對(duì)浸膏進(jìn)行多酚成分吸附，浸膏濃度22.25 μg/mL，pH中性，并配制不同濃度梯度的乙醇溶液作為洗脫液以2 mL/min的洗脫流速對(duì)吸附飽和的大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫處理，收集洗脫液經(jīng)再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于2.5 L型冷凍干燥機(jī)（LABCONCO，美國(guó)）中冷凍干燥，分別得到不同純度的云南核桃分心木多酚的干質(zhì)量，以純化后所含有的多酚質(zhì)量與洗脫液干質(zhì)量之比相對(duì)映射出云南核桃分心木多酚的純度，根據(jù)公式（2）計(jì)算云南核桃分心木多酚的純度，并確定云南核桃分心木多酚的最適洗脫液濃度，對(duì)比其粗提物中多酚的純度，分析云南核桃分心木中多酚的純化效果。

式中：m為純化后洗脫液多酚的質(zhì)量，M為純化后洗脫液的干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響

從圖2可以看出，當(dāng)液料比在60～100 mL/g的范圍內(nèi)時(shí)，隨著溶劑用量的增加，云南核桃分心木多酚提取量也逐漸升高，且升高趨勢(shì)較為顯著，當(dāng)液料比高于100 mL/g時(shí)，云南核桃分心木中多酚提取量不再增加，多酚提取量約平衡在21.34 mg GAE/g。此外，液料比增加有利于云南核桃分心木多酚與溶劑充分接觸并向溶劑中擴(kuò)散，因?yàn)樗≡蠈?duì)應(yīng)的多酚提取含量是有極限的，所以當(dāng)液料比達(dá)到某一界點(diǎn)時(shí)，液料比對(duì)多酚提取量的影響趨于平緩，因此，過(guò)多提高液料比會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，并且容易影響后續(xù)的旋蒸純化，因此，液料比宜選為100 mL/g。

圖 2 液料比對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to extraction solvent on extraction efficiency of phenolic contents obtained from Yunnan distracted wood inJ. regia

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響

從圖3可以看出，當(dāng)復(fù)合酶添加量在0.3%～0.9%范圍內(nèi)時(shí)，云南核桃分心木多酚提取量從20.54 mg GAE/g增加到21.44 mg GAE/g；當(dāng)復(fù)合酶添加量0.9%之后，云南核桃分心木多酚提取量隨復(fù)合酶添加量的增加而減少。復(fù)合酶具有協(xié)同作用，同時(shí)起著生物催化作用，適當(dāng)添加復(fù)合酶能提高云南核桃分心木利用率，有利于促進(jìn)多酚成分的浸出，因此，綜合考慮，復(fù)合酶添加量應(yīng)為0.9%。

圖 3 復(fù)合酶添加量對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響Fig.3 Effect of the amount of compound enzyme on the extraction efficiency of polyphenols from Yunnan distracted wood inJ. regia

2.1.3 溫度對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響

從圖4可以看出，當(dāng)溫度從20 ℃升高到40 ℃時(shí)，云南核桃分心木多酚提取量隨溫度的升高而明顯增加，多酚提取量從17.12 mg GAE/g增加到了21.90 mg GAE/g，且多酚提取量的變化趨勢(shì)較大，在40 ℃時(shí)多酚提取量達(dá)頂峰，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，從40 ℃升高到60 ℃，云南核桃分心木多酚提取量隨溫度的升高明顯趨于減少，其中，溫度的升高容易促進(jìn)多酚類物質(zhì)的氧化，致使多酚發(fā)生變性，影響云南核桃分心木中多酚成分有效浸出，因此，提取溫度40 ℃為宜。

圖 4 溫度對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響Fig.4 Effect of different temperatures on the extraction efficiency of polyphenols from Yunnan distracted wood inJ. regia

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化云南核桃分心木多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及分析

在多因素的試驗(yàn)系統(tǒng)中，需要應(yīng)用統(tǒng)計(jì)法優(yōu)化工藝參數(shù)，響應(yīng)面分析法便是一種優(yōu)化選擇最佳試驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)方法，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，本實(shí)驗(yàn)利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到提取條件與云南核桃分心木多酚提取量的二次回歸模型如公式（3）。

式中：Y為云南核桃分心木多酚提取量的預(yù)測(cè)值。

表 2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表 3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

從表3可以看出，模型顯著性P=0.000 2，表明回歸模型高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.053 7＞0.05，則表明失擬項(xiàng)不顯著，以上2個(gè)指標(biāo)說(shuō)明方程模型與試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)云南核桃分心木多酚的提取量進(jìn)行預(yù)測(cè)試驗(yàn)。其中模型校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.929 7，R2為0.998 9，表明此模型中92.97%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相關(guān)，且試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明該模型可以為進(jìn)一步優(yōu)化云南核桃分心木多酚的提取工藝做前提，并對(duì)相關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行分析及預(yù)估。在因素A、B、C中，A影響顯著（P＜0.05），即液料比對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響顯著，C影響極顯著（P＜0.01），即溫度對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響極顯著，B不顯著，即復(fù)合酶添加量對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響不顯著。在交互影響中，AB交互因素影響顯著（P＜0.05），說(shuō)明此試驗(yàn)中液料比與復(fù)合酶添加量之間有明顯的交互影響。根據(jù)F值可知，本試驗(yàn)中的3個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響次序?yàn)镃＞A＞B。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)響應(yīng)值的大小，并通過(guò)觀察響應(yīng)面所呈現(xiàn)的3D曲面圖變化情況，以及等高線的稀疏程度，能更直觀地反映A、B、C之間交互作用對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響，當(dāng)?shù)雀呔€呈卵圓形或馬鞍形時(shí)，則兩因素交互作用顯著，當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)，則兩因素交互作用不顯

著[23-24]。

由圖5可知，3個(gè)響應(yīng)面3D圖都是凸起呈馬鞍狀的曲面圖，變化曲面較為陡峭，各因素對(duì)多酚提取量的影響與方差分析結(jié)果相符，說(shuō)明云南核桃分心多酚提取量（響應(yīng)值）存在最大值。溫度的變化曲面較為陡峭，液料比、復(fù)合酶添加量的變化曲面相較于溫度略顯平穩(wěn)，表明溫度對(duì)云南核桃分心木多酚提取量的影響更為顯著一些，且等高線圖均為明顯的卵圓形，可表明液料比、復(fù)合酶添加量、溫度之間有較為顯著的交互作用，對(duì)于云南核桃分心木多酚提取量影響較大。

根據(jù)所建立的響應(yīng)面模型對(duì)云南核桃分心木多酚提取量進(jìn)行工藝參數(shù)最優(yōu)化分析，得到云南核桃分心木多酚提取量最佳工藝參數(shù)條件為液料比102.00 mL/g、復(fù)合酶添加量0.90%、溫度45.33 ℃，在此條件下云南核桃分心木多酚提取量可以達(dá)到22.35 mg GAE/g。其中從等高線圖中可以看出預(yù)測(cè)值都在中心軸附近，并且預(yù)測(cè)值都在試驗(yàn)范圍內(nèi)。說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂行У念A(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，且能有效反映A、B、C對(duì)核桃分心木多酚提取率的影響。

圖 5 各因素交互作用對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on polyphenal yield

2.2.3 回歸模型驗(yàn)證

通過(guò)應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)回歸方程求導(dǎo)可知，當(dāng)液料比102.00 mL/g、復(fù)合酶添加量0.90%、溫度45.33 ℃時(shí)，其理論核桃分心木多酚提取量最高，可達(dá)22.35 mg GAE/g，此時(shí)云南核桃分心木多酚提取工藝優(yōu)化效果最佳。對(duì)該優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，結(jié)果顯示云南核桃分心木多酚提取量為22.29 mg GAE/g，與理論值非常接近。

2.3 云南核桃分心木多酚洗脫純化試驗(yàn)結(jié)果分析

從圖6可知，當(dāng)乙醇濃度從60%增加到90%時(shí)，云南核桃分心多酚的純度隨乙醇濃度的增高而逐漸增加，純度從46.83%逐漸提高，且濃度為90%時(shí)云南核桃分心木多酚的純度最高，此時(shí)純度為64.42%，當(dāng)乙醇濃度高于90%時(shí)，云南核桃分心木多酚的純度隨乙醇濃度增加而減少。洗脫純化結(jié)果從效率及資源方面綜合考慮，最適宜洗脫云南核桃分心木多酚的乙醇濃度為90%；經(jīng)測(cè)定，云南核桃分心木粗提物中多酚的純度為19.74%，初步洗脫純化后其純度可達(dá)64.42%，多酚純度提高了30.64%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析得出，液料比、復(fù)合酶添加量、溫度對(duì)云南核桃分心木多酚提取量都有不同程度的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box?Behnken響應(yīng)面對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，且各因素對(duì)云南核桃分心木多酚提取量影響次序依次為C＞A＞B。云南核桃分心木多酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為液料比102.00 mL/g、復(fù)合酶添加量0.90%、溫度45.33 ℃，在該條件下云南核桃分心木多酚提取量可達(dá)22.35 mg GAE/g，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，云南核桃分心木多酚提取量的實(shí)際值為22.29 mg GAE/g，與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值相近，且實(shí)際值為理論值的99.73%。云南核桃分心木粗提液中多酚的純度為19.74%，洗脫純化后云南核桃分心木多酚純度可達(dá)62.09%，且乙醇的最適洗脫濃度為90%。