軟棗獼猴桃種質(zhì)資源潰瘍病抗性鑒定方法的建立與評價(jià)

溫欣 秦紅艷 艾軍 王月 韓先焱 李昌禹

關(guān)鍵詞軟棗獼猴桃;抗性評價(jià);細(xì)菌性潰瘍病

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變引起的嚴(yán)重的細(xì)菌性病害。因其蔓延速度快、發(fā)病范圍廣和致病性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為危害獼猴桃植株生長、限制獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害。病原菌主要從氣孔、皮孔及傷口等孔口侵入，危害樹干、枝條、葉片及花，引起樹體枝干潰爛，樹勢衰弱，葉片萎蔫和花器受損，嚴(yán)重的可致全園獼猴桃樹體死亡。研究結(jié)果表明，獼猴桃不同種之問抗性不同，軟棗獼猴桃Actinidia arguta、毛花獼猴桃A eriantha Benth.對潰瘍病抗性明顯強(qiáng)于中華獼猴桃A chinensisPlanch和美味獼猴桃A.chinensis var.deliciosa，但具體的評價(jià)結(jié)果受環(huán)境和評價(jià)手段的不同而有所差異。軟棗獼猴桃是獼猴桃屬的落葉藤本植物，對潰瘍病抗性較強(qiáng)，至今未見果園大面積發(fā)病現(xiàn)象。但軟棗獼猴桃不同種質(zhì)資源問是否存在差異，以及種內(nèi)不同種質(zhì)資源的抗性變異狀況等方面未見報(bào)道。本試驗(yàn)以51份軟棗獼猴桃種質(zhì)資源為材料，以中華獼猴桃中的高感品種‘紅陽、美味獼猴桃中的中抗品種‘徐香為對照，采用離體半木質(zhì)化枝條接種和功能葉片接種進(jìn)行抗病性評價(jià)，研究不同軟棗獼猴桃種質(zhì)資源對潰瘍病的抗性，明確不同種質(zhì)問的抗性差異，篩選抗病性較強(qiáng)的軟棗獼猴桃種質(zhì)，為提高獼猴桃抗病性及抗病品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物

51份軟棗獼猴桃資源均取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所軟棗獼猴桃資源圃。美味獼猴桃‘徐香和中華獼猴桃‘紅陽為盆栽材料。選取健康、生長勢中庸且均勻一致的半木質(zhì)化枝條和功能葉片作為試驗(yàn)材料。

1.1.2供試菌種

丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringae pv.actinidiae（Psa）菌株P(guān)SAM228為強(qiáng)致病力菌株，為西北農(nóng)林科技大學(xué)果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存，由西北農(nóng)林科技大學(xué)高小寧老師所贈(zèng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 PSAM228的GFPuv標(biāo)記

參照黃其玲等的方法，略有改進(jìn)。采用CaCle轉(zhuǎn)化法對PSAM228菌株進(jìn)行綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記，標(biāo)記的PSAM228菌株（后文稱GFPuv標(biāo)記菌株）可在485nm紫外激發(fā)光下通過535nm濾光片觀察到潰瘍病菌在離體材料中的侵染狀態(tài)。

1.2.2菌液最適培養(yǎng)時(shí)間篩選

用接種環(huán)蘸取PSAM228菌液在NA培養(yǎng)基上劃線，然后置于（25±1）℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2d。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，25℃分別振蕩培養(yǎng)12、18h和24h。在設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)問吸取菌液，稀釋后在NA培養(yǎng)基上涂板，置于（25±1）℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16h左右，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度。

1.2.3人工接種和抗性評價(jià)

取軟棗獼猴桃不同種質(zhì)資源健康、生長勢中庸且均勻一致的半木質(zhì)化枝條和功能葉片，先后用蒸餾水和無菌水洗凈備用。參考黃其玲的接種方法并結(jié)合本試驗(yàn)加以改進(jìn)。

1.2.3.1半木質(zhì)化離體枝條接種

枝條采用刻傷接種方法。將枝條剪成約15cm長，用無菌解剖刀橫切一個(gè)小口深至木質(zhì)部，滴加20μL菌液后附濕潤的無菌棉保濕。2018年采用沒有GFPuv標(biāo)記的PSAM228菌液;2019年采用GF-Puv標(biāo)記的PSAM228菌液。

1.2.3.2離體葉片接種

2018年采用針刺葉片法接種。用無菌接種針在葉片上每隔1cm刺一個(gè)小孔（避開葉脈），布滿整個(gè)葉片，并均勻地涂上沒有GFPuv標(biāo)記的PSAM228菌液，將葉柄處用濕潤的無菌棉包好。

1.2.3.3離體葉脈接種

2019年采用葉脈注射法接種。即用無菌注射器從葉片基部的葉柄處注入GFPuv標(biāo)記的PSAM228菌液20μL。

上述接種方法使用的菌液濃度均為10cfu/mL。每份資源分別接種5個(gè)枝條和5片葉片，重復(fù)3次，接菌后的枝條和葉片放人有濕潤無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，在（18±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察枝條韌皮部顏色變化和病斑長度、葉片病斑情況。接種后21d調(diào)查發(fā)病情況，刮除枝條感病部位的表皮，分別測量半木質(zhì)化枝條病斑長度、葉片病斑面積和病菌沿主葉脈發(fā)展的長度。離體葉脈接種的葉片在485nm紫外光激發(fā)下，通過535nm濾光片可觀察到GFPuv標(biāo)記菌株發(fā)出的熒光，通過熒光可方便地測量病菌延展長度。離體枝條和葉片感病情況分為7級，如表1所示。

病情指數(shù)=∑（病枝數(shù)×病級值）/（調(diào)查總枝數(shù)×最高級值）×100。

參照石志軍等的方法通過病情指數(shù)確定抗性。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：高抗，病情指數(shù)≤10;中抗，10<病情指數(shù)≤30;感病，30<病情指數(shù)≤50;中感，50<病情指數(shù)≤70;高感，病情指數(shù)>70。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2013、SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1菌液最適培養(yǎng)時(shí)間

利用平板計(jì)數(shù)法得到不同培養(yǎng)時(shí)間菌液的濃度，12h菌液濃度為10cfu/mL左右，18h菌液濃度為10cfu/mL左右，24h菌液濃度為10cfu/mL左右。接菌濃度以10cfu/mL為宜，因此18h為較佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.2不同軟棗獼猴桃種質(zhì)資源抗性鑒定與評價(jià)

通過半木質(zhì)化離體枝條和成熟葉片接種，可以看出不同抗性種質(zhì)半木質(zhì)化枝條發(fā)病后病斑大小有明顯差異（圖1），在軟棗獼猴桃種質(zhì)中‘桓優(yōu)1號發(fā)病最嚴(yán)重，但病斑長度與中華獼猴桃‘紅陽病斑長度差別較大;部分種質(zhì)對潰瘍病接近免疫，基本無發(fā)病現(xiàn)象，如雌性品種‘蘋綠和雄性品種‘綠王‘61-1等。葉片針刺接種后21d在接種部位可觀察到病斑，且不同抗性種質(zhì)病斑面積有差異。葉脈接種后發(fā)現(xiàn)有些葉片表面無明顯發(fā)病現(xiàn)象，但在波長485nm紫外光激發(fā)下，葉脈處可見明顯的帶有綠色熒光病菌侵染現(xiàn)象（圖2），且不同抗性種質(zhì)資源葉脈發(fā)病情況有明顯差異，說明使用熒光標(biāo)記的菌液接種使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。但在紫外光激發(fā)下，接種GFPuv標(biāo)記的PSAM228菌液的半木質(zhì)化離體枝條未能清晰看見綠色熒光，因此仍以測量半木質(zhì)化枝條發(fā)病的病斑長度為測量指標(biāo)。