不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果及解毒酶活性的影響

任美鳳 董晉明 李大琪 暢建武 郝曉娟 陸俊姣

關(guān)鍵詞華北大黑鰓金龜;種衣劑;防治效果;解毒酶;紅蕓豆

紅蕓豆，學(xué)名菜豆Phaseolus vulgaris L.，經(jīng)濟價值較高，是山西小雜糧出口創(chuàng)匯的主要品種之一，每年出口量約3萬t，占中國紅蕓豆出口總量的40%以上。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，根腐病嚴(yán)重危害紅蕓豆種植。由于蠐螬為害損壞種子，咬食根系，加劇病原菌入侵，加重根腐病的發(fā)生，導(dǎo)致經(jīng)濟效益受損，降低農(nóng)民種植的積極性。加之全球氣候變暖及耕作模式的變化，導(dǎo)致地下害蟲蟲口基數(shù)加大，為害時期加長。如何科學(xué)、高效防控蠐螬是當(dāng)前紅蕓豆生產(chǎn)中急需解決的關(guān)鍵問題。

華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita是土棲性金龜子的優(yōu)勢種之一，是華北旱作區(qū)重要的地下害蟲_，其幼蟲（蠐螬）取食發(fā)芽種子和根系，食性廣，為害重，為害時間長，防治非常困難。目前，生產(chǎn)中對蠐螬的防治主要采用農(nóng)藥溝施、撒毒土、灌根、毒餌誘殺等方法，費時費工，勞動成本較高。防治藥劑主要是有機磷類、氨基甲酸酯類以及苯基吡唑類等傳統(tǒng)藥劑，如：克百威、甲拌磷、毒死蜱等，此類藥劑具有劇毒或高殘留，被限制使用或禁止使用，導(dǎo)致市場上用于防治蠐螬的藥劑比較缺乏。因此，急需精準(zhǔn)的施藥方式和綠色、安全、高效的化學(xué)藥劑。

種子包衣靶向性強，農(nóng)藥利用率高，保證有限的農(nóng)藥成分集中作用于種子和根部，精準(zhǔn)化防治蠐螬，減少農(nóng)藥施用量，相比傳統(tǒng)防治方法省時省力。李進(jìn)榮等研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪和吡蟲啉種衣劑對大豆田蠐螬具有75%左右的防效;劉煜財?shù)妊芯勘砻髀认x苯甲酰胺·噻蟲嗪種衣劑對花生田蠐螬具有較高防效，但由于紅蕓豆對多種藥劑敏感，目前尚無關(guān)于紅蕓豆田蠐螬防治藥劑的相關(guān)研究。本研究選取4種懸浮種衣劑，采用室內(nèi)盆栽方法，研究其對紅蕓豆的安全性和對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果，為其防治提供科學(xué)用藥參考;采用酶學(xué)動力法測定對其解毒酶的影響，為華北大黑鰓金龜幼蟲解毒機制的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試?yán)ハx：華北大黑鰓金龜成蟲采自山西省汾陽市，室內(nèi)飼養(yǎng)待其產(chǎn)卵，將卵放人裝滿滅菌土的培養(yǎng)皿中，保持土壤濕度15%左右，放于人工氣候箱內(nèi)，在溫度（25±0.5）℃、光周期L//D=16h//8h的條件下飼養(yǎng)，待其孵化后，單頭飼養(yǎng)，選擇整齊一致的3齡幼蟲待用。

供試作物：紅蕓豆，品種為‘品金蕓3號，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供。

供試藥劑及儀器設(shè)備：50%氯蟲苯甲酰胺懸浮種衣劑（chlorantraniliprole）由美國杜邦公司提供;600 g/L吡蟲啉懸浮種衣劑（imidacloprid）由拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司提供;40%溴酰·噻蟲嗪懸浮種衣劑（cyantraniliprole·thiamethoxam）（20%溴氰蟲酰胺，20%噻蟲嗪）由瑞士先正達(dá)作物保護有限公司提供;50%吡蟲·硫雙威懸浮種衣劑（imida-cloprid·thiodicarb）（37.5%硫雙威，12.5%吡蟲啉）由江蘇龍燈化學(xué)有限公司提供;十二烷基硫酸鈉、a-萘酚、固藍(lán)B鹽、a-乙酸萘酯、丙酮、還原性谷胱甘肽、1-2，4-二硝基苯、考馬斯亮藍(lán)G-250等購于生物工程（上海）股份有限公司。所用設(shè)備主要是synergy HT多功能酶標(biāo)儀，美國佰騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1供試藥劑的防蟲效果及種子被害情況評價

播種前，按各藥劑的推薦使用劑量確定包衣量，本試驗中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC、40%溴?！む缦x嗪FSC、50 9/6吡蟲·硫雙威FSC的包衣量分別為3、4、3、4 mL/kg。先將各個藥劑按劑量調(diào)成漿狀液，然后將紅蕓豆種子和藥液倒入塑料袋中充分翻拌，待種子均勻著藥后，倒出攤開置于通風(fēng)處，晾干后備用?？瞻讓φ眨–K）用清水拌種，方法同上。

試驗共設(shè)5個處理，3次重復(fù)，每個重復(fù)10盆（11.5cm×17cm×12cm）。每盆播種大小均勻種子3粒，播深4～5cm，室溫栽培，播時每盆接華北大黑鰓金龜3齡幼蟲1頭。播種30d后，調(diào)查各處理種子被害情況、活蟲數(shù)量，并測量豆苗的株高、根長、鮮重、干重等。被害情況分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，完好無損;1級，種子被咬食5 9/6以下;2級，5%≤種子被咬食<10%;3級，10%≤種子被咬食<25%;4級，25%≤種子被咬食<50%;5級，50%≤種子被咬食。根據(jù)以下公式計算種子被害指數(shù)、蟲口存活率和防治效果。

種子被害指數(shù)=∑（各級被害株數(shù)×相對級值）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100;

蟲口存活率一處理后蟲口數(shù)/處理前蟲口數(shù)×100%;

防治效果=（對照蟲口存活率-藥劑處理蟲口存活率）/對照蟲口存活率×100%。

1.2.2供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽

S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的影響

試驗共設(shè)5個處理，將不同包衣處理的種子置于牙簽盒內(nèi)（每盒3顆種子）并放人相同體積的土壤（約占牙簽盒體積2/3），單頭飼養(yǎng)華北大黑鰓金龜幼蟲，分別于48、72、96h后收集試蟲，用去離子水清洗，吸水紙吸干水分，制備酶源。

取處理后試蟲5頭，稱重，置于預(yù)冷的研缽中，按照1：2（rn/V）比例加入預(yù)冷的pH為7.0的66 mmol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液備用，用66 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Habig等的方法并加以改進(jìn)，取100 vL酶液，加入1.3 mL 66 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.0），加入150μL 50 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液，50 μL O.03 mol/L CDNB，放入24孔板中，迅速混勻后于340 nm測出5min內(nèi)每隔1min的OD值變化;對照組不加入酶液，緩沖液加1.4mL，其他試劑體積不變，如前述測定OD值的變化。依照公式計算酶活力。

1.2.3供試藥劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

試驗處理如1.2.2，取處理后試蟲5頭，稱重，置于預(yù)冷的研缽中，按照1：2（m/V）比例加入預(yù)冷的pH為7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液，冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12 000 r/min冷凍離心20 min，用紗布過濾得上清液，再4℃，12000 r/min冷凍離心10min，取上清液備用，用0.04mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋50倍作為待測酶液。

參照Van Aspern等的方法并加以改進(jìn)，取0.5mL酶源，2.5 mL 3×10 a一乙酸萘酯，30。C恒溫水浴30 min后，加入0.5 mL顯色劑，于室溫靜置30 min，在波長600nm下測定OD值。以a-萘酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)酶源蛋白含量測定結(jié)果，計算CarE活力。

1.2.4蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法進(jìn)行測定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，處理問差異采用單因素方差分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同種衣劑對紅蕓豆出苗及生長的影響

4種種衣劑均對紅蕓豆安全，且顯著提高了出苗率、根鮮重和根干重（表1）。與對照相比，出苗率均顯著增加40百分點左右;根鮮重顯著增加50.00%～135.29%，50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC增幅最高，為135.29%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為88.24%，40%溴酰·噻蟲嗪FSC增幅較低，為50.00%;根干重顯著增加66.67%～133.33%，50%吡蟲·硫雙威FSC增幅最大，為133.33%，600 g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，均為100%，40%溴?！む缦x嗪FSC增幅較低，為66.67%。600 g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC可顯著提高紅蕓豆的莖鮮重，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴?！む缦x嗪FSC可顯著提高紅蕓豆的株高，其他2種種衣劑對其無顯著性影響。

2.2不同種衣劑的防治效果及保種效果

如表2所示，40%溴?！む缦x嗪FSC防治效果最好，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和600 g/L吡蟲啉FSC防治效果較低，分別為29.32%、19.23%，其中50%吡蟲·硫雙威FSC與50%氯蟲苯甲酰胺FSC差異不顯著。

2.3不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲解毒酶活性的影響

2.3.1不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的影響

如圖1所示，經(jīng)50%氯蟲苯甲酰胺FSC和40%溴?！む缦x嗪FSC處理48 h時，華北大黑鰓金龜幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力顯著低于對照，72、96h后酶活逐漸上升，與對照差異不顯著。經(jīng)4種種衣劑對紅蕓豆的莖干重均無顯著影響。幅為70.18%～74.92%。600 g/L吡蟲啉FSC種子被害指數(shù)最低，為6.96，40%溴?！む缦x嗪FSC種子被害指數(shù)次之，為8.25，二者差異不顯著;50%吡蟲·硫雙威FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，分別為11.19、11.70，但與40%溴酰·噻蟲嗪FSC差異不顯著。

4種種衣劑都可顯著抑制華北大黑鰓金龜幼蟲的生長，平均體重減輕0.07～0.21g，而空白對照體重平均增加0.14g。

4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數(shù)，降600g/L吡蟲啉FSC處理48 h時GSTs酶活顯著低于對照，72、96 h時逐漸提升，96 h時顯著高于對照。經(jīng)50%吡蟲·硫雙威FSC處理48 h和72 h，GSTs酶活力與對照無顯著差異;96 h時顯著高于對照。結(jié)果說明：40%溴?！む缦x嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600 g/L吡蟲啉FSC，在48 h均可顯著降低谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活以起到毒殺作用，但隨著處理時間的延長，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力均逐漸升高，且600g/L吡蟲啉FSC對其誘導(dǎo)作用較顯著;600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC處理96h均可誘導(dǎo)華北大黑鰓金龜幼蟲提高谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活以降解殺蟲劑增加存活率。

2.3.2不同種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶（CarE）活性的影響

如圖2所示，4種藥劑處理48h后華北大黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶活性均顯著高于對照;處理72h后，各處理CarE酶活性均顯著低于對照;處理96h后CarE酶活性均大于等于對照，其中50%氯蟲苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC顯著高于對照，50%吡蟲·硫雙威FSC、40%溴?！む缦x嗪FSC與對照差異不顯著。結(jié)果說明：處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威FSC和40%溴酰·噻蟲嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。酶活的波浪形變化曲線表明，華北大黑鰓金龜幼蟲動態(tài)調(diào)整羧酸酯酶酶活以抵抗4種種衣劑的不良脅迫作用。

3討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于紅蕓豆的研究主要集中于營養(yǎng)價值開發(fā)和品種選育，種衣劑的研究甚少。高效種衣劑推廣應(yīng)用的前提和關(guān)鍵是對作物的安全性，本研究結(jié)果表明，4種種衣劑均對紅蕓豆安全，能顯著提高其出苗率、根鮮重和根干重。段強等研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉種衣劑促進(jìn)玉米根長、根數(shù)等增加;尚棟亮等使用40%溴?！む缦x嗪FSC對玉米種子包衣，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)玉米生長，對幼苗生長安全無害;何發(fā)林等經(jīng)研究證實2.40、3.20g/kg種子劑量的氯蟲苯甲酰胺對花生出苗安全，以上研究均與本研究結(jié)果一致。

王猛等研究發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾、玉米螟和小地老虎的毒力比氯蟲苯甲酰胺高，與噻蟲嗪復(fù)配后增加殺蟲譜，提高防蟲效果，與本研究結(jié)果相似，40%溴?！む缦x嗪FSC防效最高，為74.81%，50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，為60.65%。何發(fā)林等經(jīng)室內(nèi)盆栽和大田試驗證實了高劑量氯蟲苯甲酰胺對玉米和花生地下害蟲的防效高于吡蟲啉，在本研究中也得到驗證，50%氯蟲苯甲酰胺FSC防治效果顯著高于吡蟲啉。復(fù)配種衣劑的防治效果高于單劑，與前人研究結(jié)果一致，50%吡蟲·硫雙威FSC防效高于600g/L吡蟲啉FSC，并且能夠有效減緩抗性的發(fā)展進(jìn)程。因此在生產(chǎn)中應(yīng)首選復(fù)配制劑防治華北大黑鰓金龜幼蟲。本研究中，4種種衣劑對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果較其他研究低，可能是因為試驗用蟲蟲齡較大，抵抗力較強，需在田間進(jìn)行進(jìn)一步試驗。

近年來，山西省紅蕓豆根腐病發(fā)生較為嚴(yán)重，分析其原因，主要是由于連茬種植，導(dǎo)致病原菌數(shù)量增多，其次是由于土壤中地下害蟲數(shù)量逐年累積，咬食種子及根部，增加病原菌入侵機會，進(jìn)而增加根腐病發(fā)病率，因此，降低蠐螬為害率對防治根腐病具有重要意義。本研究中，4種種衣劑顯著降低紅蕓豆種子被害指數(shù)，究其原因可能是由于吡蟲啉對蠐螬有驅(qū)避作用或者氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺作用于魚尼丁受體，破壞昆蟲的肌肉收縮功能，導(dǎo)致其出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，進(jìn)而降低對種子的危害程度。建議在蠐螬發(fā)生嚴(yán)重的地塊選用40%溴?！む缦x嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC 2種種衣劑，在發(fā)生較輕的地方選擇50%吡蟲·硫雙威FSC和600g/L吡蟲啉FSC 2種種衣劑，降低蠐螬為害率，減少病原菌入侵機會。

當(dāng)昆蟲受到化學(xué)藥劑脅迫時，會調(diào)節(jié)體內(nèi)的解毒酶活性來抵御逆境脅迫毒害，而使其存活。何發(fā)林等發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺可提高小地老虎體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性，但對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為前期誘導(dǎo)后期抑制，而余慧靈等報道溴氰蟲酰胺對甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶活性有不同程度的抑制作用。本研究中，4種種衣劑對兩種解毒酶的影響也不相同。40%溴酰·噻蟲嗪FSC、50%氯蟲苯甲酰胺FSC和600g/L吡蟲啉FSC，在48 h對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力的影響均表現(xiàn)為抑制作用，隨著處理時間的延長，96 h時600g/L吡蟲啉FSC和50%吡蟲·硫雙威FSC誘導(dǎo)其活性顯著增加。處理48、72h后，4種種衣劑對羧酸酯酶活性表現(xiàn)為先激活后抑制;96h時50%吡蟲·硫雙威和40%溴?！む缦x嗪FSC對羧酸酯酶活性作用不明顯，600g/L吡蟲啉FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對其有激活作用。說明不同藥劑可能由于作用方式、作用機理不同，而對同種昆蟲相同或不同解毒酶有不同影響，昆蟲調(diào)節(jié)不同解毒酶應(yīng)對不同藥劑脅迫。因此，在生產(chǎn)中用藥時一定要輪換使用，減緩抗性的產(chǎn)生，提高防效。

綜上所述，4種種衣劑可顯著降低種子被害指數(shù)，增加出苗率，促進(jìn)植物根系生長，并且40%溴?！む缦x嗪FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC對華北大黑鰓金龜幼蟲具有良好的防治效果。建議在紅蕓豆生產(chǎn)中根據(jù)蟲情針對性推廣應(yīng)用，并與其他藥劑輪換使用，以期為根腐病綜合防控提供技術(shù)參考，為紅蕓豆高效種植提供技術(shù)支撐。