循環(huán)腫瘤DNA在胰腺癌診治研究進(jìn)展

賈艷會(huì) 杜雙雙 劉樹業(yè)

1天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（天津300170）；2天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津300170）；3衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心（天津300170）

胰腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升。2019年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)頒布的數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌的5年生存率僅為9%，在美國(guó)位列惡性腫瘤死亡率第4［1］。同年，中國(guó)國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年有9.5 萬(wàn)例胰腺癌新發(fā)病例，位列我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第10 位；死亡率在男性和女性腫瘤相關(guān)死因中分別居于第6位和第7位［2］。由于缺乏完善、規(guī)范的胰腺癌早期診斷體系，導(dǎo)致胰腺癌早期診斷率和手術(shù)切除率較低，甚至在切除后，約80%的患者會(huì)因殘留病變而復(fù)發(fā)，接受完全切除的患者5年生存率約25%［3］，因此早期診治并準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)對(duì)提高預(yù)后有重要意義。影像學(xué)（CT、MRI 和超聲）、血清糖類抗原19-9（CA19-9）和組織活檢等在胰腺癌的應(yīng)用中都有一定的局限性，臨床上迫切需要一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

近年來(lái)，液體活檢（liquid biopsies）作為一種新興的腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)，在腫瘤的診治及預(yù)后中發(fā)揮著潛在的優(yōu)勢(shì)。液體活檢技術(shù)主要分析體液中的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、外泌體（exosomes）等腫瘤相關(guān)分子，具有操作簡(jiǎn)便、快速、非侵入性等優(yōu)勢(shì)。液體活檢技術(shù)中的液體除血液（全血、血清或血漿）外，還包括尿液，唾液，腦脊液等，胰液也是檢測(cè)胰腺癌的常用液體［4］。液體活檢可以反映腫瘤的基因譜，對(duì)推進(jìn)腫瘤診治的精準(zhǔn)化進(jìn)程具有重要意義。本文就ctDNA 在胰腺癌診治研究進(jìn)展作一綜述，以期給科研和臨床提供一些參考。

1 ctDNA 及其檢測(cè)技術(shù)

所有的細(xì)胞都可以通過主動(dòng)分泌或細(xì)胞壞死、凋亡的方式釋放DNA 進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中，這些DNA 統(tǒng)稱為游離DNA（cfDNA）。腫瘤細(xì)胞在凋亡和壞死過程中釋放的DNA稱為ctDNA。因此腫瘤患者cfDNA 中包含了正常細(xì)胞來(lái)源的DNA 片段和腫瘤來(lái)源的ctDNA。凋亡cfDNA長(zhǎng)度約166 ～200 bp，ctDNA 比凋亡cfDNA 要短［5］，約134 ～144 bp。由于正常血細(xì)胞凝固時(shí)可釋放DNA 到血清中，因此血漿比血清更適合檢測(cè)ctDNA［6］。從抽血到離心分離血漿的時(shí)間也很關(guān)鍵，必須在1 h 內(nèi)完成。ctDNA 濃度受腫瘤負(fù)荷的影響，正常情況下，血液中的ctDNA 濃度很低，占整個(gè)循環(huán)DNA 的0.01%左右，當(dāng)機(jī)體有腫瘤發(fā)生時(shí)，可高達(dá)90%以上［7］。良性病變、炎性疾病和組織損傷時(shí)ctDNA 濃度也會(huì)增加。ctDNA 半衰期較短，為16 min 至數(shù)小時(shí)，因此能夠反映腫瘤的實(shí)時(shí)狀態(tài)［8］。ctDNA 釋放到循環(huán)中后，會(huì)立即通過核酸酶的作用和尿液排泄從循環(huán)中清除；此外，肝臟和脾臟對(duì)其的吸收和巨噬細(xì)胞的降解也可影響循環(huán)中的清除。這種短半衰期也使早期癌癥中ctDNA 的的檢測(cè)變得困難。

ctDNA 的檢測(cè)包括濃度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)（突變、甲基化等）檢測(cè)。依據(jù)檢測(cè)原理主要分為以選擇性擴(kuò)增法為核心和以測(cè)序技術(shù)為核心的兩類技術(shù)［9］。以選擇性擴(kuò)增為核心的技術(shù)包括熒光定量PCR、微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS-PCR）、高分辨溶解曲線分析技術(shù)（HRM）等（表1），這類方法靈敏度較高，但易發(fā)生偏向性擴(kuò)增，且只可檢測(cè)已知突變。這些方法在乳腺癌、小細(xì)胞肺癌的應(yīng)用均有報(bào)道［10-12］，可以指導(dǎo)癌癥患者選擇靶向藥物，為靶向治療提供臨床診斷依據(jù)。但在胰腺癌中尚未開展利用ctDNA 指導(dǎo)靶向治療的相關(guān)研究。以測(cè)序原理為核心的技術(shù)主要包括一代測(cè)序的Sanger 測(cè)序和二代測(cè)序（NGS）（表1）。NGS 在早期腫瘤的篩查和晚期腫瘤的治療是目前臨床應(yīng)用的主要領(lǐng)域，由于腫瘤的臨床NGS 檢測(cè)仍然是一個(gè)未成熟的、充滿探索性的領(lǐng)域，現(xiàn)階段還無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，加之臨床應(yīng)用NGS 測(cè)序成本較高，造成NGS 臨床推廣應(yīng)用困難［13］。

ddPCR 技術(shù)和NGS 技術(shù)在液體活檢中互為補(bǔ)充：NGS 技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新的突變，ddPCR 可以對(duì)單個(gè)突變進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，二者聯(lián)合可以檢測(cè)0.001%稀有突變［14］。BRCA1/2、PALB2、CDKN2A、RBM10、ARID1A 等基因突變被證實(shí)與家族性胰腺癌發(fā)病密切相關(guān)［15-16］。《胰腺癌綜合診治指南（2018版）》［17］指出高通量測(cè)序技術(shù)聯(lián)合系統(tǒng)生物學(xué)分析對(duì)胰腺癌進(jìn)行分子分型，同時(shí)結(jié)合動(dòng)物模型開展藥物敏感性的臨床前研究，將為胰腺癌“個(gè)體化診療”提供思路。兩種技術(shù)結(jié)合將會(huì)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

表1 ctDNA 主要分析技術(shù)Tab.1 Main analytical techniques of ctDNA

2 ctDNA 在胰腺癌中的應(yīng)用

2.1 早期診斷和腫瘤分期早期胰腺癌是指腫瘤直徑≤2 cm，局限于胰腺內(nèi)，無(wú)胰腺外浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。胰腺癌的發(fā)生與癌基因和抑癌基因的突變密切相關(guān)，如KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A等，以KRAS 突變最常見［23］，該突變?cè)诎┳冊(cè)缙诩纯砂l(fā)生。胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是胰腺癌最常見的類型，約90%的PDAC 可檢測(cè)到KRAS 突變，但78%的ctDNA 突變不是在原發(fā)腫瘤樣本中檢測(cè)到的，這是因?yàn)樵缙谝认侔┭褐衏tDNA 濃度較低，檢測(cè)比較困難；而在腫瘤進(jìn)展時(shí)ctDNA 濃度較高更容易檢測(cè)到［24］。

KRAS 突變的ctDNA（KRASmutctDNA）的特異度高達(dá)96%，但較低的靈敏度限制了其在胰腺癌無(wú)癥狀患者篩查和早期診斷中的應(yīng)用，因此一些研究常把ctDNA 和蛋白生物標(biāo)志物聯(lián)合用于早期胰腺癌的檢測(cè)。COHEN 等［25］研究表明KRASmutctDNA單獨(dú)用于檢測(cè)早期胰腺癌的靈敏度為30%，而將KRASmutctDNA 與蛋白生物標(biāo)志物（CA19-9、癌胚抗原、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和骨橋蛋白）結(jié)合，可使靈敏度提高至64%。

異常甲基化狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，精準(zhǔn)的分期是腫瘤診治和評(píng)估預(yù)后的基礎(chǔ)。HENRIKSEN 等［26］研究結(jié)果顯示ctDNA 啟動(dòng)子甲基化在胰腺癌發(fā)展和惡化過程中積累和改變，對(duì)胰腺癌分期有較大的價(jià)值。

雖然KRASmutctDNA 和ctDNA 啟動(dòng)子甲基化對(duì)診斷早期胰腺癌有重要價(jià)值，但2019年8月美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作組（USPSTF）指出目前還沒有生物標(biāo)志物被批準(zhǔn)用于早期胰腺癌的準(zhǔn)確檢測(cè)［27］。有研究［28］指出ctDNA 可能是胰腺癌晚期生存預(yù)測(cè)的較好的生物標(biāo)志物，但在胰腺癌早期診斷中的價(jià)值不如CTC 和腫瘤外泌體。

2.2 療效評(píng)估和耐藥監(jiān)測(cè)胰腺癌術(shù)后輔助化療可以改善患者生存，因此需要可靠的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估化療方案。CA19-9 和CT 成像評(píng)估化療方案有一定的局限性，ctDNA 在監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性胰腺癌化療應(yīng)答中有潛在作用：當(dāng)治療失敗時(shí)，血漿中可檢測(cè)到耐藥胰腺癌細(xì)胞的DNA 片段，而失敗的治療又可能會(huì)促進(jìn)基因突變，導(dǎo)致耐藥。CHENG等［29］首次在轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的ctDNA 中發(fā)現(xiàn)了四種（BRCA2、EGFR、KDR 和ERBB2）有臨床意義的基因突變率，其中EGFR 在胰腺癌中過表達(dá)提示預(yù)后較差；ERBB2 突變與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可在癌細(xì)胞亞群中上調(diào)。

FOLFIRINOX（奧沙利鉑+伊利替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣）療法是晚期PDAC 患者的一線選擇。WEI 等［30］前瞻性納入38 例接受FOLFIRINOX化療的晚期PDAC 患者，發(fā)現(xiàn)化療后cfDNA 總濃度的變化與腫瘤負(fù)荷有關(guān)：在化療應(yīng)答的受試者中，特定改變基因座的等位基因片段比例下降；而對(duì)該化療方案耐藥的患者，ctDNA 突變等位基因片段（mutant allele fraction，MAF）增加。他們不僅提供了治療前ctDNA 水平與PDAC 腫瘤負(fù)荷相關(guān)的證據(jù)，也證實(shí)了連續(xù)的cfDNA 分析是監(jiān)測(cè)化療應(yīng)答的有力工具。

Eryaspase（L-天冬酰氨酶包埋于紅細(xì)胞）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的治療方法，聯(lián)合吉西他濱或FOLFOX（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶）可作為轉(zhuǎn)移性胰腺癌的二線治療方案。BACHET 等［31］前瞻性搜集晚期胰腺癌患者治療前、后的血漿，評(píng)估ctDNA 對(duì)Eryaspase 治療胰腺癌預(yù)測(cè)和預(yù)后的價(jià)值，最后得出結(jié)論：ctDNA 的基線水平是無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素；ctDNA 水平的早期變化與治療效果有關(guān)，因此ctDNA可以做為評(píng)估Eryaspase 對(duì)晚期胰腺癌患者療效的生物標(biāo)志物。

除化療外，胰腺癌治療還包括免疫治療和不可逆性電穿孔等方法，ctDNA 在這些治療中的應(yīng)用也有報(bào)道［32-33］，不過目前多在臨床試驗(yàn)階段。ctDNA 可用于監(jiān)測(cè)治療的應(yīng)答和耐藥性，并能比組織活檢更好地捕獲腫瘤異質(zhì)性，因此化療過程中ctDNA 可能是早期治療效果的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

2.3 識(shí)別術(shù)后MRD、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及評(píng)估生存期PDAC 術(shù)后較高的復(fù)發(fā)率是PDAC 高死亡率的原因之一。常規(guī)術(shù)后監(jiān)測(cè)方法包括臨床癥狀、CA19-9 等腫瘤標(biāo)志物和CT 成像對(duì)微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）缺乏敏感性和特異性，因此迫切需要一種可靠的方法來(lái)識(shí)別MRD 并預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。研究表明ctDNA 可以識(shí)別MRD，對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)具有較高的敏感性。SAUSEN 等［34］應(yīng)用ddPCR 技術(shù)檢測(cè)早期胰腺癌患者血漿發(fā)現(xiàn)：術(shù)后檢出ctDNA 的患者比未檢出ctDNA 的患者更易復(fù)發(fā)；ctDNA 預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的平均時(shí)間為3.1 個(gè)月，而CT確定復(fù)發(fā)的平均時(shí)間為9.9 個(gè)月，因此胰腺癌患者術(shù)后血漿ctDNA 可以較早預(yù)測(cè)外科術(shù)后是否有病灶殘留或疾病復(fù)發(fā)。GROOT 等［35］不僅有相同的結(jié)論，還評(píng)估了ctDNA 預(yù)測(cè)PDAC 術(shù)后復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確率為89%，他們的研究證實(shí)ctDNA 檢測(cè)是PDAC 術(shù)后復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)因子。

JIANG 等［36］分析PDAC 患者術(shù)前及術(shù)后血漿ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ctDNA 檢出率隨PDAC 分期的增加而增加；ctDNA 的最大變異等位基因分?jǐn)?shù)（variant allelic fraction，VAF）與腫瘤最大直徑正相關(guān)；術(shù)后ctDNA 陽(yáng)性是無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）的獨(dú)立因素。因此術(shù)后監(jiān)測(cè)ctDNA 可以識(shí)別MRD，從而預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。PIETRASZ 等［37］研究結(jié)果表明ctDNA 與DFS 和OS 負(fù)相關(guān)，是晚期胰腺癌患者一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物。HADANO等［38］有類似的發(fā)現(xiàn)。但他們只證實(shí)了ctDNA 陽(yáng)性提示預(yù)后不良，均未分析術(shù)后及治療后ctDNA 濃度變化。BETTEGOWDA 等［39］則進(jìn)行了ctDNA 濃度方面的相關(guān)研究，結(jié)果表明生存率隨ctDNA 濃度的增加而下降。因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA 濃度可以盡早區(qū)分疾病穩(wěn)定和病情進(jìn)展，評(píng)估預(yù)后。

綜上，檢測(cè)胰腺癌患者術(shù)前和術(shù)后血漿ctDNA 有非常重要的意義：如果胰腺癌患者術(shù)前的血漿中檢測(cè)到ctDNA，則可選擇術(shù)前化療而避免不必要的開腹手術(shù)；若胰腺癌患者術(shù)后血漿中未檢測(cè)到ctDNA，則需考慮更強(qiáng)的輔助治療方案，這既有助于對(duì)高?；颊咛峁┏浞值妮o助治療，又可避免對(duì)低?；颊叩倪^度治療［40］。

3 總結(jié)與展望

精準(zhǔn)的個(gè)體化治療是癌癥治療的新目標(biāo)。在個(gè)體化理念下，胰腺癌的精準(zhǔn)治療需要全面評(píng)估患者個(gè)體差異如伴隨的基礎(chǔ)疾病，以及腫瘤個(gè)體差異如大小、數(shù)目、播散轉(zhuǎn)移及血管浸潤(rùn)等情況，以實(shí)現(xiàn)治療的精準(zhǔn)化，提高患者生活質(zhì)量。ctDNA代表了腫瘤細(xì)胞的基因組信息，可以反映患者整體疾病的基因組狀態(tài)，為精準(zhǔn)醫(yī)療和制定胰腺癌個(gè)體化治療方案提供了一新的參考模式。然而迄今為止，經(jīng)FDA 批準(zhǔn)的ctDNA 檢測(cè)只可用于轉(zhuǎn)移性和局部進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）及晚期乳腺癌等極少數(shù)癌癥［41］。要實(shí)現(xiàn)ctDNA 對(duì)早期腫瘤尤其是早期胰腺癌的篩查和診治還面臨一些挑戰(zhàn)，具體如下：（1）ctDNA 檢測(cè)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)規(guī)范：2019 國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心開展的ctDNA 室間質(zhì)評(píng)共計(jì)173 個(gè)假陽(yáng)性、67 個(gè)假陰性突變結(jié)果，因此ctDNA 檢測(cè)質(zhì)量仍有待提高［42］。（2）缺乏高靈敏度的檢測(cè)方法：胰腺癌早期（Ⅰ期、Ⅱ期）ctDNA 檢出率不超過30%［43］；2019 國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心開展的ctDNA 室間質(zhì)評(píng)中，cfDNA 平均提取效率僅為41.5%，因此亟需高靈敏度的檢測(cè)方法［42］。（3）目前可嘗試用于治療胰腺癌的分子靶點(diǎn)不多，加之胰腺癌具有較強(qiáng)的腫瘤異質(zhì)性和功能復(fù)雜的間質(zhì)成分，其基于基因測(cè)序進(jìn)行精準(zhǔn)治療的難度更大［44］。如何從血液中分離足量、高質(zhì)量的cfDNA，并將ctDNA 從正常的cfDNA中區(qū)分出來(lái)，這是研究ctDNA 的關(guān)鍵。臨床需要建立指導(dǎo)方針和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，積極開展臨床多中心研究，從而使ctDNA 成為腫瘤精準(zhǔn)治療一個(gè)強(qiáng)大的科研和臨床工具。