RSV誘導哮喘小鼠樹突細胞自噬機制及五虎湯的干預作用

張鑫　王孟清　羅銀河　胡燕　丁伊　江智豪

〔摘要〕 目的 研究PI3K/Akt/mTOR信號通路對呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）誘導哮喘小鼠樹突細胞（dendritic cells， DC）自噬的調(diào)控機制及五虎湯的干預作用。方法 用RSV滴鼻聯(lián)合霧化雞卵清蛋白（ovalbumin， OVA）激發(fā)的方法制備哮喘小鼠模型，造模后的小鼠分為模型組、五虎湯低劑量組、五虎湯中劑量組、五虎湯高劑量組、地塞米松組、雷帕霉素組、氯喹組，每組10只，并設空白組（10只）對照。實驗結(jié)束后PAS、Masson染色觀察評價肺組織病變情況，并計算氣道黏液儲備指數(shù)與膠原沉積指數(shù);電鏡觀察自噬小體;Western blot檢測DC自噬相關蛋白及對PI3K/Akt/mTOR信號通路中關鍵蛋白PI3K、p-Akt、p-mTOR表達的影響。結(jié)果 氣道反應性結(jié)果顯示造模成功。病理染色顯示模型組小鼠氣道黏液儲備指數(shù)與膠原沉積指數(shù)較空白組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組相比，五虎湯各劑量組及其他藥物組哮喘小鼠氣道黏液儲備指數(shù)與膠原沉積指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。電鏡下觀察小鼠肺組織自噬小體顯示模型組相較于空白組中自噬小體數(shù)量明顯增加，各治療組的自噬小體較模型組增加。Western blot顯示，自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在五虎湯各劑量組以及雷帕霉素組中的表達顯著增高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平較模型組降低（P<0.01）;地塞米松組與模型組比較，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平相對表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）;通路關鍵蛋白表達水平顯示，五虎湯各劑量組及雷帕霉素組中PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達水平與模型組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）。結(jié)論 RSV誘導哮喘小鼠樹突細胞自噬水平上升，PI3K/Akt/mTOR信號通路被活化，五虎湯通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，進一步上調(diào)樹突細胞的自噬，減輕氣道重塑。

〔關鍵詞〕 兒童哮喘;五虎湯;呼吸道合胞病毒;樹突細胞;細胞自噬;PI3K/Akt/mTOR

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.008

〔Abstract〕 Objective To study the regulation mechanism of PI3K / Akt / mTOR signaling pathway on RSV-induced autophagy of dendritic cells in asthmatic mice and the intervention effect of Wuhu Decoction. Methods The mouse model of asthma was established by RSV nasal drop combined with ovalbumin （OVA） atomization. After modeling， mice were divided into the model group， the Wu-hu Decoction low-dose group， the Wu-hu Decoction medium-dose group， the Wu-hu Decoction high-dose group， the dexamethasone group， the rapamycin group and the chloroquine group， with 10 mice in each group， and a blank group （10 mice）. After the end of the experiment， PAS staining and Masson staining were used to observe and evaluate the pathological changes of lung tissue， and the airway mucus reserve index and collagen deposition index were calculated; autophagy was observed by electron microscopy; Western blot was used to detected the autophagy-related proteins of DC and their effects on the expression of PI3K， p-Akt， and p-mTOR in the PI3K / Akt / mTOR signaling pathway. Results The airway reactivity results showed that the model was successful; pathological staining showed that the airway mucus reserve index and collagen deposition index of mice in the model group were significantly higher than the blank group， and the difference was statistically significant （P<0.01）; compared with the model group， the airway mucus reserve index and collagen deposition index of asthma mice in Wu-hu Decoction each dose groups and other drug groups decreased， with statistical significance （P<0.01）. Observation of autophagosomes in mouse lung tissue under electron microscope showed that the number of autophagosomes in the model group was significantly increased compared with the blank group， and the autophagosomes in each treatment group increased compared with the model group. Western blot showed that the autophagy protein LC3Ⅱ / LC3Ⅰin Wu-hu Decoction each dose groups and the rapamycin group were significantly higher than the model group， with statistical significance （P<0.01）; the LC3Ⅱ / LC3Ⅰlevel of the chloroquine group was lower than the model group （P<0.01）; there was no significant difference in the relative expression of LC3Ⅱ / LC3Ⅰbetween the dexamethasone group and the model group （P>0.05）; the key proteins expression levels of pathway showed that the protein expressions of PI3K， p-Akt and p-mTOR in Wu-hu Decoction dose groups and rapamycin group were significantly lower than the model group， and the difference was statistically significant （P<0.01， P<0.05）. Conclusion The autophagy level of DC cells in RSV-induced asthma mice increased， and the PI3K / Akt / mTOR signaling pathway was activated. Wuhu Decoction inhibited the PI3K / Akt / mTOR signaling pathway to further up-regulate DC cell autophagy and reduce airway remodeling.

〔Keywords〕 childhood asthma; Wu-hu Decoction; respiratory syncytial virus; dendritic cells; cell autophagy; PI3K / Akt / mTOR

哮喘是最常見的兒童慢性呼吸道疾病，全球范圍內(nèi)患病人數(shù)呈逐年上升的趨勢[1]，兒童哮喘與呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）感染有密切的關系，大部分兒童哮喘患者起源于RSV的感染[2]。RSV感染人體后首先被抗原提呈細胞攝取，進而誘發(fā)機體的免疫反應。樹突細胞（dendritic

cells， DC）是最重要的一種抗原提呈細胞[3]。細胞自噬是細胞利用溶酶體降解自身物質(zhì)以適應生存環(huán)境的過程，病毒感染會誘發(fā)DC的自噬[4]。研究表明自噬會影響DC的抗原提呈功能，而DC自噬功能的紊亂是哮喘重要的發(fā)病機制[5-6]。中藥復方五虎湯是治療兒童哮喘的名方，對病毒誘發(fā)的哮喘有很好的療效，前期臨床實驗證實，五虎湯可通過嬰幼兒哮喘的DC細胞，影響T細胞因子IL-4、IL-5的分泌[7]，前期動物實驗亦證實，五虎湯可通過干預RSV誘導的DC自噬對哮喘小鼠的氣道反應性、炎性因子的分泌產(chǎn)生影響[8-9]，但其具體的分子機制不明。本研究旨在通過動物實驗進一步驗證療效，探明其分子機制。

1 材料

1.1? 動物

90只SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南斯萊克景達公司，動物資格證書編號：SCXK（湖南）2016-0002。小鼠在12 h∶12 h光暗交替的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，可自由飲水和進食，以標準普通飼料喂養(yǎng)，實驗在湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行，許可證號：SYXK（湘）2019-0004，本研究中實驗動物經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準同意，批準號：20180810-02。

1.2? 藥物與試劑

五虎湯（組成：生石膏9.0 g、生甘草2.4 g、杏仁6.0 g、麻黃2.4 g、細茶葉4.8 g），每瓶100 mL，含生藥24.6 g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科制備;地塞米松（美國Sigma公司，批號D1756）;雷帕霉素（美國Selleckchem，批號S1039）;氯喹（美國 Selleckchem，批號C193834）;RSV Long株由武漢大學醫(yī)學部病毒學研究所提供;雞卵清蛋白、Masson、PAS染色液（上海Solarbio公司，批號9006-59-1、G1285）;氯化乙酰膽堿（美國Selleck公司，批號2260-50-6）;Lung Dissociation Kit（mouse）、CD11c Micro Beads Ultra Pure（mouse）、AutoMACS Running Buffer（德國美天旎生物公司，批號130-095-927、130-108-3381、130-091-221）;LC3 I、LC3 Ⅱ兔抗多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號4599S、3868S;PI3K、p-Akt、p-mTOR（美國CST 公司，批號4249S、S4060S、5536S）;β-actin鼠單抗（美國Immunoway公司，批號YM3028）。

1.3? 主要儀器

S888E超聲霧化器（南京道芬電子有限公司）;DHX-50小動物呼吸機與WESTERN BLOTP氣道阻力和肺順應性分析軟件（美國BUXCO公司）;HT7700透射電子顯微鏡（日立高新技術(shù)公司）;臺式離心機（金壇市大地自動化儀器廠）。

2 方法

2.1? RSV誘發(fā)哮喘小鼠模型建立

將90只SPF級雌性BALB/c小鼠編號，隨機數(shù)字表法選取15只為空白組，剩余小鼠為造模組。參照課題組前期研究文獻的造模方法[8-10]，實驗前2 d，造模組小鼠分別鼻腔滴入滴度為2.4×106 PFU的RSV，每只0.05 mL，同時腹腔注射1% OVA以致敏，0.25 mL/只，空白組給予等容積Hep-2細胞滴鼻，同時皮下注射等容積的生理鹽水。自實驗第9日起，于上午9：00將造模組小鼠放入自制的霧化箱中，以10 mL濃度為1% OVA霧化激發(fā)，空白組給予同樣體積的生理鹽水，每次30 min，隔天1次，持續(xù)2周。

2.2? 氣道反應性檢測驗證造模是否成功

從空白組和造模組小鼠中分別隨機抽取5只進行氣道反應性測定，驗證造模是否成功。小鼠末次給藥后24 h，麻醉后切開氣管，進行氣管插管后，把小鼠放入體描箱中，連接呼吸機，調(diào)整呼吸機參數(shù)，頻率為75次/min，潮氣量為8 mL/kg，記錄初始的氣道壓力、流速以及潮氣量變化，待小鼠氣道壓力平穩(wěn)后，霧化吸入0.1 mL不同濃度的乙酰膽堿（0、6.25、12.5、25、50 mg/mL），每次吸入乙酰膽堿后，收集吸入后5 s到1 min的數(shù)據(jù)，并用軟件計算出最大肺阻力。

2.3? 動物分組及給藥

選取造模成功的小鼠70只，隨機分成模型組、五虎湯低劑量組、五虎湯中劑量組、五虎湯高劑量組、陽性對照組（地塞米松組）以及自噬誘導組（雷帕霉素組）、自噬抑制劑組（氯喹組）每組各10只，并選取空白組10只進行對照。小鼠按體表面積折算，臨床等效關系擬定五虎湯中劑量組灌胃3.2 g/kg，0.5倍等效劑量五虎湯低劑量組灌胃1.6 g/kg，2倍等效劑量五虎湯高劑組灌胃6.4g/kg，并腹腔注射等容積的生理鹽水;地塞米松組腹腔注射地塞米松1.82 mg/kg，并以等容積生理鹽水灌胃;雷帕霉素組腹腔注射雷帕霉素1 mg/kg，并灌胃等容積生理鹽水;氯喹組腹腔注射氯喹60 mg/kg，并灌胃等容積生理鹽水;空白組及模型組灌胃并腹腔注射等容積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥14 d。

2.4? 肺組織病理染色

PAS染色步驟如下：肺組織切片后用二甲苯脫蠟，再用乙醇洗去二甲苯，隨后分別用95%、85%、75%的乙醇進行水化，再用Weigert鐵蘇木素液染色5 min，水洗，以阿利新藍染色液染色10～20 min，再放入氧化劑中進行氧化5 min，再放入Schiff Reagent浸染10 min，蘇木素染色液染核1～2min，再用Scott藍化液返藍，水洗3 min，行脫水、透明、封片處理后鏡檢，Masson染色步驟如下：脫蠟、水化與PAS染色相同，用藍化液返藍5 min，麗春紅品紅染色液染色5 min再用磷鉬酸溶液洗2 min，苯胺藍染色液中染色1 min，再進行脫水、透明、封片處理后鏡檢。用ImagePro Plus 6.0系統(tǒng)對PAS、Masson染色的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算氣道膠原沉積指數(shù)與黏液儲備情況，每組圖片重復計算3次。

2.5? 透射電鏡觀察肺組織自噬體

實驗結(jié)束后取肺組織，用2.5%的戊二醛、磷酸鹽濃度為0.22 mmol/L緩沖液固定4 h左右，0.1 mol/L磷酸漂洗10～15 min，重復3次，再以1%鋨酸后固定2 h，逐級乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋，30 ℃烘箱過夜后再用60 ℃烘箱內(nèi)烘12 h，切成厚度為50～100 nm的薄片，最后用醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色后在透射電鏡下進行肺組織自噬體檢查。

2.6? CD11c磁珠分選法分離肺組織樹突細胞

取肺組織及氣道組織，用外科剪充分剪碎，加入膠原酶IV后在37 ℃下孵育45 min，再碾磨、過濾、加紅細胞裂解液制成肺單細胞懸液，Percoll液 4 ℃梯度離心30 min，采用300×g離心細胞懸液10 min，完全吸出上清液，每1×108細胞加入100 μL CD11c磁珠，充分混合后在冰箱中避光孵育10 min，隨后再加入緩沖液，離心10 min，吸出上清液，測定細胞數(shù)目，500 μL緩沖液重懸。隨即將色譜柱置于MACS分離器磁場中，用3 mL適量緩沖液沖洗LS色譜柱后，將細胞懸浮液注入柱中，待液體凈，用適緩沖液洗滌柱子3次，取出色譜柱并將其放在合適的收集管上。移取5 mL緩沖液到色譜柱后，隨即將柱塞推入柱中，沖刷出磁性標記細胞，即獲得所需的樹突細胞。

2.7? Western blot檢測自噬相關蛋白LC3 I、LC3 II及PI3K/Akt/mTOR 信號通路關鍵蛋白表達

從分離的DC中提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每組稱取50 μg的總蛋白，按照1∶4的比例加入SDS上樣緩沖液，在沸水浴中加熱5 min，在預制膠孔中加入樣本，然后進行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，用5%的牛奶封閉1 h，分別加入LC3 I（稀釋比1∶2 000）、LC3 II（稀釋比例1∶1 000）、兔抗多克隆抗體和內(nèi)參β-actin（稀釋比例1∶5 000），進行孵育，用8% SDS-PAGE從每組取40 μg的總蛋白，特定的一抗PI3K（稀釋比例1∶1 000）、p-Akt（稀釋比例1∶1 000）、p-mTOR（稀釋比例1∶2 000）兔抗多克隆抗體和內(nèi)參β-actin（稀釋比例1∶5 000）孵育過夜，用TBST洗滌10 min，共3次，用過氧化物酶標記二抗后加入，室溫與膜孵育1 h，再次洗滌。凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，掃描后用quantity one灰度分析軟件進行光密度計算，以被檢測的蛋白條帶灰度值/β-actin灰度值作為目的蛋白的相對表達水平。

2.8? 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用“x±s”表示。兩組數(shù)據(jù)比較，滿足正態(tài)性和方差齊性，用配對t檢驗，多組比較滿足正態(tài)性和方差齊性的計量資料采用完全隨機設計資料的方差分析，其中，各組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊者用Dunett's T3檢驗，不滿足正態(tài)性用秩和檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01表明差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1? 兩組小鼠氣道阻力比較

不同濃度的乙酰膽堿（0、6.25、12.5、25、50 mg/mL）激發(fā)小鼠氣道阻力顯示，造模組小鼠均比空白組小鼠的氣道阻力明顯增高（P<0.01），說明造模成功。見表1。

3.2? 各組哮喘小鼠肺組織PAS、Masson染色情況比較

PAS染色結(jié)果如圖1所示，相較于空白組，模型組管腔內(nèi)杯狀細胞與黏液分泌較多，五虎湯組與地塞米松組、雷帕霉素組、氯喹組治療后，視野內(nèi)的杯狀細胞與黏液分泌減少;軟件定量分析PAS染色紅染陽性區(qū)域，與模型組相比，五虎湯各劑量組及其他藥物組均可降低哮喘小鼠氣道黏液儲備指數(shù)（P<0.01）。Masson染色結(jié)果如圖2所示，模型組小鼠與空白組相比氣道壁則增厚;與模型組比較，五虎湯組、地塞米松組、雷帕霉素組及氯喹組氣道壁厚度均有不同程度的減輕。軟件定量分析Masson染色藍染陽性區(qū)域測定氣道膠原沉積指數(shù)，與模型組相比，五虎湯組、地塞米松組、雷帕霉素組及氯喹組均可顯著降低哮喘小鼠氣道膠原沉積指數(shù)（P<0.01）。見表2。

3.3? 各組小鼠電鏡檢查情況比較

在透射電鏡下觀察比較各組小鼠肺組織自噬小體，模型組相較于空白組中自噬小體數(shù)量明顯增加;與模型組相比，五虎湯各劑量組雷帕霉素及氯喹的自噬小體增加。見圖3。

3.4? 各組小鼠自噬相關蛋白表達情況

Western blot檢測各組自噬相關蛋白LC3 I、LC3 Ⅱ如圖4所示，模型組與空白組比較LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，五虎湯低、中、高劑量組與雷帕霉素組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;氯喹組LC3Ⅱ/

LC3Ⅰ水平降低（P<0.01）;地塞米松組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平相對表達的差異無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表3。

3.5? 各組小鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路關鍵蛋白的表達

模型組PI3K、p-Akt、p-mTOR的水平較空白組顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，五虎湯各劑量組與地塞米松組、雷帕霉素組均可降低PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。氯喹組的PI3K、p-Akt表達水平與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4和圖5。

4 討論

RSV感染是兒童哮喘的重要誘因[11]，DC被認為是RSV作用人體的始動因子，RSV作用人體后被DC攝取、抗原提呈，導致T細胞免疫失衡，使哮喘發(fā)作[3]。細胞自噬是細胞利用溶酶體降解自身物質(zhì)以適應生存環(huán)境的過程，病毒感染會誘發(fā)機體細胞的自噬[5]。研究表明自噬可以影響DC的抗原提呈功能[12]。DC自噬功能的紊亂或失調(diào)可能是哮喘重要的發(fā)病機制[5]。

五虎湯是治療小兒喘證的名方，全方由麻黃、杏仁、石膏、甘草、細茶5味藥物組成，功效為清肺平喘。臨床上對病毒性性哮喘有很好的療效。本次實驗采用RSV滴鼻聯(lián)合OVA霧化的方法構(gòu)建病毒性哮喘小鼠動物模型，對五虎湯治療病毒誘發(fā)哮喘的療效及分子機制進行研究。實驗結(jié)果顯示，相較于空白組，模型組小鼠肺組織病理切片呈現(xiàn)炎性細胞浸潤、氣道杯狀上皮數(shù)量增加、氣道上皮膠原沉積，提示模型小鼠氣道中存在炎癥、氣道高反應，并且氣管壁發(fā)生了氣道重塑，經(jīng)五虎湯干預后各項指標改善，表明五虎湯對RSV誘導的哮喘小鼠有保護作用。在透射電鏡下觀察到，空白組小鼠的肺組織中未見自噬小體，而模型組中的自噬小體明顯增加，經(jīng)五虎湯、雷帕霉素、氯喹干預后肺組織中自噬小體數(shù)量繼續(xù)增加。根據(jù)文獻中的報道，自噬小體數(shù)量增加并不代表自噬水平一定增加，有可能因自噬溶酶體部分降解受阻引起的自噬小體堆積[13]。因此，我們對小鼠肺DC的自噬的蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平進行檢測，結(jié)果顯示五虎湯各劑量組與雷帕霉素組中LC3Ⅱ/

LC3Ⅰ水平增高，而氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低，提示五虎湯可上調(diào)RSV感染后的DC自噬水平，而氯喹通過干擾自噬溶酶體的降解而抑制自噬。

PI3K/Akt/mTOR信號通路可以負向調(diào)節(jié)細胞自噬[14]。該通路主要由PI3K、Akt、mTOR 3個作用分子組成，其中的PI3K參與細胞自噬的啟動，激活下游的蛋白[15-16]。Akt是一種蛋白激酶，被激活后發(fā)生磷酸化，發(fā)揮自噬信號傳遞、自噬體運動、囊泡融合作用[17]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target

of rapamycin， mTOR）是細胞自噬、增殖的調(diào)節(jié)因子，上游的p-Akt可以使mTOR磷酸化，從而使其活性增強，自噬受到抑制[18]。一些研究[19-20]表明PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控的自噬可使細胞纖維化，在呼吸道表現(xiàn)為氣道壁的增厚及僵硬，并最終引起氣道的重塑。實驗結(jié)果表明，抑制該通路的雷帕霉素，可以減輕氣道重塑，與文獻[21]報道相一致。同時，也有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路對DC功能的調(diào)節(jié)具有重要作用[22]。實驗結(jié)果顯示RSV誘導哮喘模型小鼠肺中DC細胞PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平增高，與空白組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;說明DC細胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，給予五虎湯、雷帕霉素干預后PI3K、p-Akt、p-mTOR表達水平呈下降趨勢，與模型組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），而氯喹組PI3K、p-Akt與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），我們推測中藥五虎湯可抑制該通路，增強DC的自噬功能從而減輕氣道重塑。綜上所述，五虎湯治療RSV誘發(fā)哮喘的機制可能是抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，進而上調(diào)DC的自噬水平，減輕氣道重塑。

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