調(diào)控植物葉片內(nèi)在大小的分子機(jī)制

張禾，李磊

北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871

1 植物器官生長由基因和環(huán)境共同調(diào)節(jié)

植物是地球上分布最廣泛的高等生命形態(tài)，植物器官大小在不同物種間表現(xiàn)出了巨大的多樣性，對器官大小的精確調(diào)控是植物在地球上生存繁衍的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)[1]。一株種子植物通?？梢砸暈槎鄠€(gè)相同組分的集合，例如叢生的葉片以及多輪的花器官(萼片、花瓣和心皮等)，這表明發(fā)育具有顯著的可重復(fù)性，能夠在個(gè)體間不斷產(chǎn)生具有相同大小、形狀和功能的特定器官[2-3]。一方面，植物器官的最終大小和形狀必須依據(jù)發(fā)育階段和環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便最有效地利用植物的周圍環(huán)境，例如，葉片捕獲陽光以及花器官吸引傳粉者等；另一方面，即便在環(huán)境達(dá)到最優(yōu)時(shí)，器官大小也只在相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)波動(dòng)，如擬南芥的葉片不會長到睡蓮葉片的尺寸[2]。因此，植物器官生長到特定大小是一個(gè)由基因進(jìn)行程序性調(diào)控并受到環(huán)境調(diào)節(jié)的過程[4]。

植物器官生長是一種胚后生長方式，主要有兩類：一類以葉片為代表，由確定性生長達(dá)到最終尺寸的生長模式；另一類以根為代表，以具有無限生長潛力的頂端生長模式進(jìn)行不確定性生長[5]。通常植物器官發(fā)生由分生組織開始，分生組織由一群多能干細(xì)胞組成，這些細(xì)胞始終保持著自身的未分化狀態(tài)[6]。當(dāng)前的研究認(rèn)為植物有三種分生組織：一是莖分生組織，產(chǎn)生葉片、腋枝、花原基和莖組織；二是根分生組織，維持根的伸長、生長，根分生組織還包括側(cè)根分生組織，產(chǎn)生側(cè)根根系；三是維管分生組織，主要功能是使得運(yùn)輸組織進(jìn)行精細(xì)化分工，在木質(zhì)植物中形成韌皮部和木質(zhì)部以及莖的增厚等[7]。簡單來說，分生組織通過細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張產(chǎn)生器官原基，隨后器官原基進(jìn)一步生長分化形成新的植物器官。

2 葉片生長過程

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，提供植物生長發(fā)育所需的物質(zhì)能量，同時(shí)供給人類社會食品、飼料和工業(yè)原料[8]。在真雙子葉植物中，葉片起始于莖頂端分生組織，分生組織產(chǎn)生葉原基，再由葉原基經(jīng)過發(fā)育長成為成熟葉片。以擬南芥為例，葉原基向成熟葉片的轉(zhuǎn)化通常被定義為兩個(gè)連續(xù)且重疊的階段。第一階段，在生長素積累高而細(xì)胞分裂素積累低的區(qū)域，葉原基從莖頂端分生組織的側(cè)面開始發(fā)育，整個(gè)葉原基在這一階段都處在活躍的細(xì)胞分裂周期中，由此產(chǎn)生體積相對恒定的子細(xì)胞。隨著發(fā)育的進(jìn)行，在葉片末端出現(xiàn)了阻滯區(qū)，細(xì)胞增殖被限制在葉片基部，這一區(qū)域的細(xì)胞數(shù)目會持續(xù)增加，直至增殖活動(dòng)完全停止。遠(yuǎn)端細(xì)胞則在一段時(shí)間后退出細(xì)胞分裂周期，進(jìn)入有絲分裂后的擴(kuò)張階段，也就是第二階段。這一時(shí)期的生長是通過細(xì)胞自身體積的增大并伴隨著細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的倍性增加而完成的(內(nèi)復(fù)制是指細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生了多輪基因組復(fù)制，但并不發(fā)生細(xì)胞分裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞倍性增加的現(xiàn)象)。在第二階段，葉片細(xì)胞分裂停止后，細(xì)胞開始快速擴(kuò)張，與分生組織或葉原基增殖區(qū)的細(xì)胞相比，此時(shí)增大的細(xì)胞呈現(xiàn)高度的空泡化，即液泡顯著增大，從而導(dǎo)致細(xì)胞體積大幅度增加。葉片上細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張?jiān)跁r(shí)間上并不完全分開，因此第一和第二階段之間的重疊部分也被描述為過渡階段。此時(shí)葉尖部分的細(xì)胞首先停止分裂，而更多的葉片基部細(xì)胞(包括遠(yuǎn)端的氣孔和原形成層細(xì)胞)仍然繼續(xù)增殖，葉片上增殖區(qū)和非增殖區(qū)之間的邊界迅速出現(xiàn)，而且這一邊界與葉基部的距離在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)保持恒定。隨后，當(dāng)所有表皮細(xì)胞停止增殖后，這一邊界就迅速消失。除了以上兩個(gè)階段的細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張的發(fā)育調(diào)控過程外，葉片中的分生組織通過不對稱分裂，形成保衛(wèi)細(xì)胞和氣孔。因此，也有研究將葉片生長更細(xì)化為五個(gè)重疊且關(guān)聯(lián)的過程，即發(fā)育起始、一般細(xì)胞分裂、過渡階段、細(xì)胞擴(kuò)張和分生組織分裂。綜上，葉片從葉原基開始最終形成了一個(gè)扁平的雙面結(jié)構(gòu)，并且具有顯著的前后極性、背腹極性和中外側(cè)極性[7-11]。

葉片最終大小受到了嚴(yán)格的時(shí)空遺傳調(diào)控。當(dāng)前模式植物擬南芥的遺傳研究為理解葉片發(fā)育的復(fù)雜過程提供了強(qiáng)有力的工具，是研究真雙子葉植物單葉發(fā)育的主要模型[12]。最近多項(xiàng)研究揭示了葉片大小的具體調(diào)控機(jī)制，認(rèn)為至少有四個(gè)主要的細(xì)胞發(fā)育過程影響了葉片大?。阂皇侨~原基起始的細(xì)胞數(shù)量；二是葉片細(xì)胞增殖的速率和持續(xù)時(shí)間；三是葉片細(xì)胞擴(kuò)張的速率和持續(xù)時(shí)間；四是分生組織分裂的程度[11,13-14]。以上過程的改變通常會導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量或細(xì)胞大小的變化，從而影響葉片最終大小。因此，細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張的精確調(diào)控是決定葉片最終大小的關(guān)鍵因素。

3 細(xì)胞增殖與細(xì)胞擴(kuò)張作用基因

細(xì)胞增殖是指細(xì)胞將遺傳信息復(fù)制后傳遞給分裂產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞的過程。這一過程由多種細(xì)胞周期蛋白及其互作蛋白進(jìn)行調(diào)控(圖1)。得益于擬南芥中突變體的研究，目前對于參與葉片增殖的基因有了較為詳細(xì)的了解[14]。葉原基發(fā)育起始于生長素濃度高的區(qū)域，而葉片發(fā)育調(diào)控持續(xù)受到植物激素的作用。植物特異的小蛋白ARGOS受生長素誘導(dǎo)而表達(dá)，而ARGOS蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，能夠刺激DNA結(jié)合蛋白ANT(ANTEGUMENTA)的表達(dá)，ANT又能促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，并最終促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)ANT和ARGOS突變后，細(xì)胞增殖停止提前，細(xì)胞數(shù)目減少，葉片減小，而且ANT的活性受到auxin response factor family(ARFs)的抑制，從而參與到生長素信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中[15]。

圖1 擬南芥葉片大小作用因子。葉片的最終大小主要取決于細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張，這兩個(gè)生長階段都受到多種基因編碼的作用因子調(diào)控(圖中，葉片基部標(biāo)注的基因主要在細(xì)胞增殖中起作用，葉尖部分標(biāo)注的為細(xì)胞擴(kuò)張作用因子，用黑色字體表示，箭頭為促進(jìn)作用，T形符號為抑制作用。ANT，ANTEGUMENTA；ARFs，auxin response factors；Class Ⅰ TCP，Ⅰ類TCP，TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF；BB，BIG BROTHER；GRFs，growth-regulating factors；GIF，GRF interacting factors；ABP1，AUXIN BINDING PROTEIN 1；ARL，ARGOS-LIKE；AN，ANGUSTIFOLIA；ROT3，ROTUNDIFOLIA 3；TOR，target of rapamycin)

另一類重要的調(diào)控通路涉及TCP(TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF)轉(zhuǎn)錄因子家族。TCP隸屬于b-HLH轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-loophelix-type transcription factors)家族，在分蘗、葉片增殖、花器官發(fā)育中均起重要的調(diào)控作用。TCP結(jié)構(gòu)域是一種植物特異的DNA結(jié)合基序，能夠特異性地結(jié)合到被稱作“site Ⅱ elements”的順式元件上。目前研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中共有24個(gè)TCP家族成員，根據(jù)DNA結(jié)合域的結(jié)構(gòu)分為Ⅰ類TCP(包括13個(gè)成員)和Ⅱ類TCP(包含11個(gè)成員)兩個(gè)類別。Ⅰ類TCP對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用依賴于特異的時(shí)空表達(dá)模式[15-17]；Ⅱ類TCP也被稱為CINTCPs(CINCINNATA-like TCPs)，它通過促進(jìn)細(xì)胞分化，能夠及時(shí)阻止葉片增殖，讓葉片順利進(jìn)入下一階段的發(fā)育進(jìn)程中，是細(xì)胞分裂過渡到細(xì)胞擴(kuò)張的重要調(diào)控因子[15]。例如：TCP4通過抑制細(xì)胞分裂素的作用間接限制細(xì)胞的增殖生長[9,18-19]；TCP14和TCP15能夠與酶蛋白SPY進(jìn)行互作，共同促進(jìn)葉片和花中細(xì)胞分裂素響應(yīng)[16,20]，而且TCP14和TCP15的穩(wěn)定性受到另一種泛素結(jié)合蛋白DA1的調(diào)節(jié)。DA1能夠使TCP14、TCP15以及TCP22失活，同時(shí)DA1還與E3泛素連接酶DA2協(xié)同作用。在da1-1和da2-1突變體中，由于細(xì)胞增殖時(shí)間延長，葉片相較于野生型更大，而DA1又能被E3連接酶BB(BIG BROTHER)激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖生長期[21-23]。與CIN-TCPs相對的是，GRF(GROWTH-REGULATING FACTOR)轉(zhuǎn)錄因子及其作用因子GIF(GRF-INTERACTING FACTOR)則通過維持細(xì)胞增殖周期來正向調(diào)控葉片大小[24]。

與細(xì)胞增殖相比，對于細(xì)胞擴(kuò)張的調(diào)控基因的了解相對較少(圖1)。這是因?yàn)椋阂环矫?，?xì)胞擴(kuò)張的機(jī)制更為復(fù)雜，例如介導(dǎo)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ABP1(AUXIN BINDING PROTEIN 1)基因，在發(fā)生異位表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞增大，但同時(shí)細(xì)胞數(shù)量發(fā)生代償性減少，因此整個(gè)器官的大小并沒有變化；另一方面，器官發(fā)育具有極性，如擬南芥an(angustifolia)突變體由于在葉寬方向上細(xì)胞擴(kuò)張的特定缺陷而具有更窄更厚的葉片。相對地，rot3(rotundifolia 3)突變體具有更寬的葉片和花器官是因?yàn)樵谌~長軸方向存在細(xì)胞擴(kuò)張缺陷[25-27]。此外，還有研究報(bào)道了擬南芥ARGOS基因的同源基因ARL(ARGOS-LIKE)低表達(dá)或過表達(dá)時(shí)分別導(dǎo)致較小或較大的葉片。這些變化主要是由于ARL促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張進(jìn)而促進(jìn)器官生長[25]。過表達(dá)由TOR(TARGET OF RAPAMYCIN)基因編碼的激酶也會導(dǎo)致細(xì)胞變大，產(chǎn)生更大的葉片[2,28]。

4 植物細(xì)胞壁組分與功能

細(xì)胞擴(kuò)張的具體機(jī)制依賴于植物獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。與動(dòng)物細(xì)胞不同，植物細(xì)胞被一層柔韌的細(xì)胞外基質(zhì)即細(xì)胞壁所包圍，而細(xì)胞壁也是植物能夠成為地球上最廣泛的高等生命形態(tài)的原因之一。細(xì)胞壁的隔離能夠使得植物細(xì)胞不受環(huán)境因素(如陽光、空氣、水和礦物質(zhì)營養(yǎng)等)的直接作用[29-31]，并且抵抗病原體入侵，充當(dāng)了細(xì)胞損傷的防護(hù)屏障，保護(hù)植物細(xì)胞免受各種環(huán)境和生物脅迫的侵害[32]。細(xì)胞壁位于細(xì)胞質(zhì)膜和中膠層之間(厚度為0.1～1 μm)，是一種處在動(dòng)態(tài)變化中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由相互作用的多糖、蛋白質(zhì)、多酚、小分子和水組成。細(xì)胞壁將植物細(xì)胞彼此黏附，從而在生長過程中將這些細(xì)胞的相對位置鎖定在適當(dāng)?shù)牡胤揭灾С种参锷L。細(xì)胞壁在細(xì)胞外側(cè)形成一個(gè)強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)，壓縮了內(nèi)部的原生質(zhì)體，由此可認(rèn)為植物細(xì)胞的生長由內(nèi)部膨壓和細(xì)胞壁延展性之間的平衡所決定[3,33]。在生長過程中，細(xì)胞體積有時(shí)會發(fā)生巨大變化，甚至達(dá)到幾個(gè)數(shù)量級的差別，因此細(xì)胞壁需要以高度受控的方式來松動(dòng)，以便在體積變化時(shí)不對細(xì)胞造成損傷[34]?？傊?，細(xì)胞壁充當(dāng)了原生質(zhì)體與細(xì)胞外環(huán)境之間的接口，為植物細(xì)胞提供感知外部變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在生長發(fā)育過程中決定發(fā)育形態(tài)和機(jī)械特性[35-37]。

細(xì)胞壁主要分為三種主要類型：第一類是在活躍生長的植物細(xì)胞上沉積而形成的初生細(xì)胞壁，主要包含多糖(纖維素、半纖維素及果膠)和蛋白質(zhì)；第二類是次生細(xì)胞壁，存在于特定分化的細(xì)胞類型中，主要成分為多糖(纖維素、半纖維素等)和木質(zhì)素；第三類為中膠層，主要成分為果膠，中膠層直接來源于細(xì)胞胞質(zhì)分裂過程中產(chǎn)生的細(xì)胞板[38-39]。細(xì)胞生長過程中初生細(xì)胞壁沉積在中膠層上。通常在所有細(xì)胞類型中都存在初生細(xì)胞壁和中膠層，但只有在某些特定類型細(xì)胞停止生長后，初生細(xì)胞壁上才會沉積次生細(xì)胞壁[29]。

三種類型的細(xì)胞壁具有不同的化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)及生物學(xué)功能。盡管初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁都直接充當(dāng)了細(xì)胞的機(jī)械外殼，能夠抵抗從內(nèi)到外的膨脹壓力和從外到內(nèi)的壓縮力，但只有初生細(xì)胞壁能夠響應(yīng)施力后產(chǎn)生的延伸變形，從而確定細(xì)胞生長的方向和速率。因此，研究人員普遍認(rèn)為是初生細(xì)胞壁決定了細(xì)胞生長的速率和方向[39-40]。除了以上的機(jī)械作用外，初生細(xì)胞壁還是細(xì)胞間信息交流處理系統(tǒng)的一部分[41]。

初生細(xì)胞壁中三種主要多糖成分的占比分別為：纖維素占30%，半纖維素占30%，果膠占35%[42]。纖維素是初生細(xì)胞壁的主要機(jī)械成分，具有與鋼相近的抗拉強(qiáng)度。它由多個(gè)β-1,4-葡聚糖鏈組成，這些葡聚糖鏈通過氫鍵結(jié)合在一起形成電纜狀的纖維素微纖維，構(gòu)成細(xì)胞壁骨架[35,43-44]。最新的模型認(rèn)為纖維素微纖維是初生細(xì)胞壁的主要承重成分，由纖維素合成酶復(fù)合物合成，在高爾基體中組裝后輸送到質(zhì)膜上[45-47]。有報(bào)道顯示，擬南芥纖維素酶缺陷突變體中纖維素含量降低，葉片和子葉面積顯著減少[48]。

半纖維素是存在于所有陸地植物中的一種多糖鏈，包括木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖[49]。木葡聚糖是主要的半纖維素，其分支結(jié)構(gòu)包括β-1,4-葡聚糖主鏈和側(cè)鏈，側(cè)鏈組有木糖、半乳糖和巖藻糖殘基[50]。鑒于半纖維素的結(jié)構(gòu)、生化特性和細(xì)胞分布的多樣性，有越來越多的酶及代謝途徑被認(rèn)為參與到了半纖維素的生物合成中[51-53]。研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素通過充當(dāng)纖維素微纖維之間的黏合層影響細(xì)胞壁力學(xué)特征，增強(qiáng)細(xì)胞壁強(qiáng)度，并在生長過程中控制微纖維在外力作用下的運(yùn)動(dòng)[54-57]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)木葡聚糖水解酶會導(dǎo)致葉片面積增大[58]。

果膠是一類與其他細(xì)胞壁基質(zhì)多糖不同的獨(dú)特成分，具有大量半乳糖醛酸形式的酸性糖和少量的葡萄糖醛酸[59-61]。果膠的生物合成也從高爾基體開始，高爾基體是多室細(xì)胞器和細(xì)胞壁多糖的“工廠”。果膠是決定細(xì)胞壁生物物理性質(zhì)的主要因素，如黏附力、內(nèi)聚力和延展性。越來越多的研究證明，果膠對細(xì)胞生長和組織形態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而這些作用在之前的研究中未受到重視[60,62]。例如，利用固態(tài)核磁共振波譜分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁中纖維素-果膠的作用更為廣泛，而纖維素-木葡聚糖的連接卻比先前設(shè)想的要少[63]。目前，研究者已鑒定出三種主要類型的果膠多糖，即高半乳糖醛酸(HG)、鼠李糖醛酸Ⅰ(RG-I)和鼠李糖醛酸Ⅱ(RG-Ⅱ)。其中，HG是主要形式，約占所有細(xì)胞壁果膠的2/3[64]。HG的化學(xué)結(jié)構(gòu)為α-1,4糖苷鍵連接的半乳糖醛酸線性鏈[59,61]。半乳糖醛酸亞基可進(jìn)行化學(xué)修飾，在O2和O3位置上乙?；?，在C6位置上甲酯化[65-66]。RG-I的主鏈由交替的半乳糖醛酸和鼠李糖殘基組成，并錨定阿拉伯糖、半乳糖和阿拉伯半乳聚糖側(cè)鏈。RG-Ⅱ是一種高度保守的復(fù)雜果膠，其主鏈與HG相同，側(cè)鏈含有13種不同的糖基和20多種不同的糖基鍵[38]。研究表明，HG、RG-I和RG-II之間通過共價(jià)鍵連接[67]。果膠及其組分的生物合成過程十分復(fù)雜，至少需要67種不同類型的酶參與[68]。據(jù)報(bào)道，在擬南芥基因組中有730多個(gè)基因編碼了可能的糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基水解酶[69]。有研究將高爾基體分離出體外進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以此來確定可能參與到果膠多糖生物合成中的酶等蛋白質(zhì)[65]。然而，由于這些酶大多是具有活性形式的完整膜蛋白，使用酶解或者酸堿破壞共價(jià)鍵等方法逐步降低果膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，也使得這些研究當(dāng)中丟失了很多重要的信息。這些因素加上缺乏可靠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，導(dǎo)致分離和跟蹤單個(gè)特定基因非常困難。因此，果膠生物合成相關(guān)基因的生物學(xué)功能和遺傳調(diào)控作用，在很大程度上仍然是未知的[70]。

5 植物miRNA調(diào)控生長發(fā)育

MicroRNA(miRNA)是一類長度為20～24個(gè)核苷酸且具有調(diào)控作用的內(nèi)源非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。它們存在于藻類和植物等絕大多數(shù)的真核生物當(dāng)中，在基因調(diào)控中起著重要作用[71-72]。miRNA先由細(xì)胞核內(nèi)MIR基因轉(zhuǎn)錄形成較長的單鏈RNA，稱為miRNA初級轉(zhuǎn)錄本(primary transcripts, pri-miRNAs)；隨后pri-miRNA通過剪切折疊等過程形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(miRNA precursor, premiRNA)；pre-miRNA再次剪切形成miRNA雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈打開后形成兩條RNA單鏈，其中負(fù)義鏈稱為miRNA*，隨后被降解，正義鏈則為成熟的miRNA。在動(dòng)物和植物中，miRNA的形成過程有所差異，包括介導(dǎo)剪切的酶也不同。在動(dòng)物中，對miRNA初級轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行切割的酶是Drosha，形成的miRNA前體從細(xì)胞核被運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，再由Dicer進(jìn)行第二步的剪切[73]；而在高等植物中，miRNA的兩步剪切都是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的，主要是由DCL1(Dicer like 1)進(jìn)行剪切。剪切后的雙鏈結(jié)構(gòu)再運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，形成成熟的miRNA，通過和AGO蛋白的結(jié)合，產(chǎn)生RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)[74]，最終完成對目標(biāo)mRNA的剪切或翻譯抑制，從而沉默靶基因[75]。

miRNA通過與靶基因堿基互補(bǔ)配對而發(fā)揮功能。在動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)中，miRNA與靶基因的配對區(qū)域通常限制在miRNA的3＇端的種子區(qū)，只結(jié)合而不剪切，miRNA形成的沉默復(fù)合體打破了靶基因mRNA合成的平衡從而抑制基因表達(dá)[76]。植物當(dāng)中miRNA起作用的方式則主要通過miRNA與具有切割功能的蛋白組成的沉默復(fù)合體RISC對靶基因的mRNA進(jìn)行剪切。miRNA發(fā)揮作用時(shí)與靶基因的堿基配對程度較為靈活，這就決定了它們調(diào)控靶基因數(shù)量和種類的多樣性。目前在植物當(dāng)中已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA靶基因約有幾百個(gè)，但結(jié)合多種生物信息學(xué)預(yù)測工具所得出的數(shù)據(jù)綜合分析，僅僅擬南芥中約300個(gè)miRNA就對應(yīng)了約5 000個(gè)靶基因，說明仍然存在很多潛在的miRNA與靶基因的作用方式[77]。

目前對miRNA及其靶基因調(diào)節(jié)發(fā)育過程的認(rèn)知，集中體現(xiàn)在植物生長多細(xì)胞互作方面，例如生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分生組織的邊界形成和器官分離、葉片的發(fā)育和極性形成、側(cè)根的形成、從幼年到成年的營養(yǎng)生長期與開花生殖期的轉(zhuǎn)換、花器官特征和繁殖等[78-81]。有趣的是，有些miRNA不單獨(dú)行使功能，而通過相互重疊的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮作用[82-83]。

葉片的生長發(fā)育涉及多個(gè)相互協(xié)調(diào)的miRNA(圖2)。在葉片形成初期，需要建立分生組織細(xì)胞、未分化細(xì)胞和具有分化潛能細(xì)胞之間的界限。器官邊界的調(diào)控因子CUC1、CUC2(CUPSHAPED COTYLEDON1/2)被證實(shí)受miR164調(diào)控。過表達(dá)miR164影響器官的正常分離，導(dǎo)致子葉、葉片及花序莖和莖生葉發(fā)生異常融合；而破壞miR164及其靶基因之間的互作，則會導(dǎo)致葉片葉序和葉片形狀的異常[78,84]。在葉片發(fā)育后期，miR319對靶基因TCP家族的調(diào)控是細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)張中的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR319及TCP基因功能缺失的多重突變體中一致產(chǎn)生葉片增大、葉邊緣卷曲等表型[72]。然而，通過突變TCP4與miR319的結(jié)合位點(diǎn)獲得的TCP4過表達(dá)植株，則顯示出葉片縮小的表型。如前所述，TCP4又是調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子[9,83]，因此miR319通過影響細(xì)胞周期而調(diào)控葉片發(fā)育，而且miR319也與調(diào)控葉片形態(tài)發(fā)生的miR164-CUC通路相關(guān)聯(lián)[83]。同時(shí)，CIN-TCPs還可以反過來促進(jìn)miR396的表達(dá)，而miR396靶向編碼GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的基因。GRF及GIF一同維持細(xì)胞分裂，因此在grf及gif缺陷突變體中葉片更小更窄(圖2)[85]。

圖2 葉片生長miRNA調(diào)控通路。葉片的大小發(fā)育受到多個(gè)miRNA的調(diào)控。葉原基到發(fā)育早期葉片，miR164 靶向邊界調(diào)控因子CUC1、CUC2；在葉片發(fā)育后期，miR319調(diào)控TCP4參與到細(xì)胞增殖與細(xì)胞擴(kuò)張過程。CIN-TCPs促進(jìn)miR396表達(dá)，miR396調(diào)控GFR(圖中，miRNA及蛋白作用因子用黑色字體表示，箭頭為促進(jìn)作用，T形符號為抑制作用。CUC1/2，CUP-SHAPED COTYLEDON1/2；TCP4，TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF 4；GRF，growthregulating factors)

miRNA除了對細(xì)胞增殖周期基因的直接作用外，還可以通過靶向細(xì)胞壁多糖基因來對葉片大小進(jìn)行調(diào)控。最近研究者在擬南芥中鑒定了23個(gè)預(yù)測靶向細(xì)胞壁多糖合成基因的miRNA，并將其命名為細(xì)胞壁miRNA(CW-miRNA)。以miR775的功能特性為例，研究發(fā)現(xiàn)miR775能夠靶向一種編碼糖基轉(zhuǎn)移酶31家族的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因GALT9。過表達(dá)miR775會產(chǎn)生更大的葉片，敲除GALT9也得到同樣的表型。研究者通過對miR775過表達(dá)材料及靶基因敲除材料中大葉片的細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些葉片中細(xì)胞大小顯著增大但細(xì)胞增殖未發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些增大細(xì)胞的細(xì)胞壁中果膠含量顯著下降。研究者利用原子力顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，果膠的下降伴隨了細(xì)胞壁彈性模量的顯著降低。以上結(jié)果證明，miR775-GALT9通路通過調(diào)控細(xì)胞壁上果膠水平和細(xì)胞壁彈性模量來控制單個(gè)細(xì)胞大小并進(jìn)而調(diào)控器官大小(圖3)[86]。

圖3 MIR775A-GALT9 通路調(diào)控葉片內(nèi)在大小。miR775抑制GALT9的表達(dá)，細(xì)胞壁上果膠含量下降，細(xì)胞壁剛性降低，葉片細(xì)胞增大從而導(dǎo)致葉片更大。從左到右為miR775與靶基因互作、初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖(橘黃色柱體為纖維素，藍(lán)色曲線為果膠，綠色曲線為半纖維素)及植物葉片

6 展望

在細(xì)胞水平，細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張這兩個(gè)過程是確定葉片最終大小的決定因素。盡管當(dāng)前人們在了解葉片最終大小的調(diào)控機(jī)制方面已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但一些重要的問題只得到部分回答，而其中一些關(guān)鍵問題將會是未來研究的熱門領(lǐng)域。一個(gè)關(guān)鍵問題是細(xì)胞在分裂或擴(kuò)張過程中如何主動(dòng)監(jiān)控自身大小的。細(xì)胞內(nèi)外的協(xié)調(diào)作用共同決定了細(xì)胞命運(yùn)和器官建成，這其中需要準(zhǔn)確的時(shí)空調(diào)控和信號交流。既然細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張的過程都涉及細(xì)胞壁的動(dòng)態(tài)變化，那么細(xì)胞壁是否參與監(jiān)控細(xì)胞大小呢？外部細(xì)胞壁又是如何感知細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)程的變化而改變自身的組分和理化性質(zhì)的？細(xì)胞壁作為一種超級復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，據(jù)估計(jì)植物將高達(dá)約10%的基因投入到細(xì)胞壁的生物合成和調(diào)控中[57]，這些基因在生長發(fā)育過程的不同時(shí)期使得細(xì)胞壁發(fā)生特定的變化。miRNA調(diào)控正是植物體內(nèi)一種靈活高效的調(diào)控方式，植物生長發(fā)育及器官的生長都受到miRNA網(wǎng)絡(luò)的廣泛控制。同時(shí)，這些miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也受到轉(zhuǎn)錄因子的級聯(lián)調(diào)控，而miRNA又能反過來作用在轉(zhuǎn)錄因子和功能基因上，這一反饋調(diào)控方式使得miRNA能夠更好地調(diào)控生長發(fā)育進(jìn)程。

鑒于細(xì)胞壁多糖的復(fù)雜性，對其生物合成的化學(xué)基礎(chǔ)和調(diào)控模式仍然需要更深入的研究。未來利用多種實(shí)驗(yàn)和計(jì)算技術(shù)分離目標(biāo)蛋白、開發(fā)酶分析方法以及構(gòu)建多組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來建立分子和物理模型都是至關(guān)重要的研究方向。