梁媛媛 涂 曄 安曉強(qiáng) 江 鍵△ 崔黎麗#
(1 海軍軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)勤系數(shù)理教研室,上海 200433;2 上海市東方醫(yī)院,上海 200120;3 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)
細(xì)胞的遷移、生長和增殖是重要的生命運(yùn)動(dòng),它在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育、創(chuàng)面修復(fù)、炎癥反應(yīng)等各種生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[1-5]。
細(xì)胞是一類電偶極子,在外電場作用下細(xì)胞膜表面會(huì)產(chǎn)生極化現(xiàn)象,駐極體產(chǎn)生的穩(wěn)定外靜電場對調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增殖和趨電遷移具有重要影響[6-11]。研究駐極體對細(xì)胞遷移和增殖的影響具有重要的基礎(chǔ)研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。前期的大量研究結(jié)果雖然已經(jīng)基本明確駐極體產(chǎn)生的外電場可以調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、遷移和凋亡等,但對駐極體調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制及其調(diào)控路徑的研究較少,尤其是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的細(xì)胞周期及其周期調(diào)控機(jī)制的研究更是鮮見報(bào)道。p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生命活動(dòng)中其重要作用[12-14]。本文研究駐極體靜電場調(diào)控p53 合成對成纖維細(xì)胞生長和增殖的影響,為駐極體生物效應(yīng)研究提供新途徑和新思路。
膜厚為13 μm的聚丙烯(polypropylene,PP)商品膜(東麗株式會(huì)社,日本),經(jīng)低溫等離子體放電系統(tǒng)(電暈充電系統(tǒng))制備成不同表面電位的正極性和負(fù)極性駐極體(雙裸面,無金屬電極)。針尖電壓為:-15 kV;柵壓分別為5 000V 和-5 000V;充電時(shí)間為5 min。駐極體的等效表面電位通過振動(dòng)電容靜電計(jì)(北京華晶科技有限公司)測量。將表面電位為0的PP膜設(shè)為對照組,將表面電位為5 000V 和-5 000V的駐極體分別設(shè)為5 000V 駐極體組和-5 000V 駐極體組,簡稱5 000V組和-5 000V組。
清潔級SD雄性大鼠,體質(zhì)量(180±20)g,購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胰蛋白酶、胎牛血清、1640培養(yǎng)基和雙抗等購于Gibco公司;PBS緩沖液購于Servicebio公司;CCK-8 試劑盒購于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司;RNA 提取液購于武漢賽維爾生物科技有限公司;Hoechst 33342 購于上海如吉生物科技有限發(fā)展公司;定量PCR引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司提供;水合氯醛等常用試劑均購于中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
將大鼠麻醉后剔除背部毛發(fā),潔凈背部皮膚,取下皮膚組織,用含有青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的PBS 緩沖液沖洗,洗凈后將皮膚組織剪成小塊(1~2 mm3)置于含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,待成纖維細(xì)胞從組織塊周圍爬出,待爬出的細(xì)胞有較多數(shù)量時(shí),吸取培養(yǎng)液并用0.25%胰蛋白酶37℃消化細(xì)胞1~2 min,轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞傳代,待細(xì)胞傳至3~8 代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
取對數(shù)生長期第3代的成纖維細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(細(xì)胞密度104個(gè)/孔),將表面電位為0、-1 000、-2 000、-5 000、1 000、2 000V和5 000V駐極體分別作用于成纖維細(xì)胞24、48 h和72 h。隨后向各孔的細(xì)胞液中加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)1~4 h后,振蕩搖勻后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京諾亞威儀器儀表有限公司)在450 nm波長處測定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值(OD值),吸光度值越高,表示細(xì)胞的增殖活性越強(qiáng)。相對增殖能力強(qiáng)弱用細(xì)胞增殖率表示:增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD平均值)/(對照組OD平均值-空白組OD平均值)。式中空白組為無細(xì)胞的培養(yǎng)組。
取對數(shù)生長期第3 代的成纖維細(xì)胞,在培養(yǎng)皿(已去除培養(yǎng)液)中加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min后,制成2×107/L的單細(xì)胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),在1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,將0、-5 000V 和5 000V 駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期。
取對數(shù)生長的成纖維細(xì)胞,將0V、-5 000V和5 000V駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h后,加入TRIzol 裂解液提取細(xì)胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,定量檢測擴(kuò)增p53的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。p53上游引物序列為5'-GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3',下游引物序列為5'-GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA-3'。PCR反擴(kuò)增條件為95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s,39個(gè)循環(huán)。采用公式2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量,每個(gè)樣品取3個(gè)復(fù)管,取均值。
采用SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示,兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果(圖1)顯示經(jīng)常溫等離子體制備的不同表面電位正、負(fù)極性聚丙烯駐極體的等溫表面電位衰減曲線,常溫充電的正極性和負(fù)極性聚丙烯駐極體具有優(yōu)異的電荷儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在常溫下存放24 h,-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的80%、76%和65%;在常溫下存放72h,-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的77%、73%和63%。說明不同表面電位的負(fù)極性駐極體可以提供穩(wěn)定的外靜電場用于后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)(圖1A)。且相同表面電位正、負(fù)極性駐極體的電荷儲(chǔ)存具有相似的規(guī)律(圖1B):常溫下存放72 h,5 000V 駐極體的等效表面電位為初始值的62%,與-5 000V 駐極體在常溫下存放72 h的等效表面電位(初始值的63%)基本一致,這表明相同表面電位的正、負(fù)極性駐極體能夠提供大小相同的外靜電場。
圖1 不同表面電位駐極體等效表面電位隨時(shí)間的變化規(guī)律
與對照組相比,不同表面電位負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h,細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng),駐極體的等效表面電位越高(提供的靜電場強(qiáng)度越大),成纖維細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)(圖2)。-5 000V 駐極體組細(xì)胞的增殖能力較對照組提高(1.080±0.051)倍。不同表面電位正極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h,細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱,駐極體的等效表面電位越高(提供的靜電場強(qiáng)度越大),成纖維細(xì)胞的增殖能力越弱。5 000V 駐極體組細(xì)胞的增殖能力是對照組的(0.900±0.059)倍(圖3)。負(fù)極性駐極體促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖作用和正極性駐極體抑制成纖維細(xì)胞的增殖作用與駐極體(或靜電場)的作用時(shí)間呈正相關(guān)。
圖2 不同表面電位正極性和負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞72 h 對細(xì)胞增殖能力的影響
圖3 正極性和負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞不同時(shí)間對細(xì)胞增殖能力的影響
與對照組相比,經(jīng)-5 000V駐極體作用48 h的細(xì)胞群中處于G1期的細(xì)胞數(shù)明顯下降,從77.79%±0.52%下降至72.63%±0.07%;而G2期的細(xì)胞數(shù)顯著上升,從13.07%±0.99%增加至23.85%±0.76%(圖4B),這說明負(fù)極性駐極體作用成纖維細(xì)胞,縮短了細(xì)胞在G1期所滯留的時(shí)間,使細(xì)胞快速通過S期到達(dá)G2期,負(fù)極性駐極體具有促進(jìn)細(xì)胞生長的機(jī)制之一是縮短細(xì)胞的生長周期。5 000V駐極體作用成纖維細(xì)胞48 h,處于G1期細(xì)胞的比例較對照組顯著上升從77.79%±0.52%上升至81.43%±0.17%,而G2期的細(xì)胞明顯下降從13.07%±0.99%減少至11.85%±0.52%(圖4C),這說明正極性駐極體產(chǎn)生的外靜電場通過使細(xì)胞阻滯于G1期而抑制細(xì)胞的生長。
圖4 不同實(shí)驗(yàn)組作用成纖維細(xì)胞48 h后的細(xì)胞周期圖
5 000 V 駐極體和-5 000V 駐極體分別作用成纖維細(xì)胞48 h后,與對照組相比,經(jīng)5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細(xì)胞中p53 mRNA的表達(dá)量為1.30±0.10,是對照組的1.3倍(P<0.05)。而經(jīng)-5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細(xì)胞中p53 mRNA的表達(dá)量卻下降至0.71±0.07,是對照組的0.7倍(P<0.05)。提示負(fù)極性駐極體通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)水平,誘導(dǎo)細(xì)胞快速通過G1期,實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
低頻電場的生物效應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的問題。已有很多報(bào)道表明電刺激可以影響生物大分子的合成與分解,離子通道的變化,以及細(xì)胞增殖等[15-18]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TFG-β)和p53基因是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。p53基因可通過抑制有絲分裂的過程,阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA 合成期,其表達(dá)增加能夠促使細(xì)胞凋亡[19]。我們在前期系統(tǒng)研究駐極體對成纖維細(xì)胞TFG-β 調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上[20],研究駐極體靜電場對成纖維細(xì)胞p53基因的影響。通過研究成纖維細(xì)胞在不同極性和表面電位的駐極體靜電場過作用下,細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡基因表達(dá)的變化,闡述駐極體靜電場調(diào)控p53 合成對成纖維細(xì)胞生長和增殖的影響。
本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示:經(jīng)低溫等離子體放電系統(tǒng)制備的不同極性聚丙烯駐極體具有優(yōu)異的電荷儲(chǔ)存能力,且負(fù)極性駐極體具有促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖的作用,而正極性駐極體具有抑制細(xì)胞生長和增殖的作用。此外,負(fù)(或正)極性駐極體促進(jìn)(或抑制)細(xì)胞生長和增殖的作用與駐極體產(chǎn)生的外靜電場強(qiáng)度以及電場作用細(xì)胞的時(shí)間長短呈正相關(guān)。正極性駐極體通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期,從而抑制細(xì)胞的增殖。而負(fù)極性駐極體則通過加快細(xì)胞通過G1期限制點(diǎn)的時(shí)限,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。因此進(jìn)一步證明,駐極體產(chǎn)生的靜電場通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。我們推測這是因?yàn)椋厚v極體產(chǎn)生的靜電場作用于成纖維細(xì)胞的主要作用靶點(diǎn)是細(xì)胞的細(xì)胞膜,靜電場作用于成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞的膜電位(或膜電容)發(fā)生改變,從而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的極化,以及細(xì)胞膜上各類膜蛋白、糖蛋白、氨基酸、生長因子和細(xì)胞因子等極化和再分布,由此影響成纖維細(xì)胞的生長周期,調(diào)控細(xì)胞的分化與增殖。
綜上所述,當(dāng)細(xì)胞處于外靜電場環(huán)境下,電場作為外源刺激因子將引起成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生變化,可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA的表達(dá)水平從而調(diào)控細(xì)胞的分化與增殖。