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    MicroRNA-182-5p對高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷的影響*

    2021-04-28 13:49:30崔元生尚祥李龍彪劉建雄陳陣許舒國
    西部醫(yī)學 2021年4期
    關(guān)鍵詞:高糖內(nèi)皮內(nèi)皮細胞

    崔元生 尚祥 李龍彪 劉建雄 陳陣 許舒國

    (1.寧德師范學院附屬寧德市醫(yī)院介入科,福建 寧德 352100;2.武漢市中心醫(yī)院急診科,湖北 武漢 430014)

    糖尿病是一種嚴重危害人體健康的常見慢性病。最新研究顯示,我國糖尿病加權(quán)患病率為11.2%,患者人數(shù)達1.56億,約占全球糖尿病總?cè)藬?shù)1/4。2017年,我國與糖尿病相關(guān)的醫(yī)療保健費用高達1100億美元,居全球第二[1]。糖尿病血管病變是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要表現(xiàn),其是由于慢性高血糖狀態(tài)及繼發(fā)的各種病理、生理改變而導致的系統(tǒng)或局部的血管損傷,是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[2]。內(nèi)皮細胞位于血管壁內(nèi)層,長期直接暴露于高血糖刺激,因此人們認為內(nèi)皮損傷是糖尿病血管病變的始動環(huán)節(jié)[3]。在高糖刺激下,內(nèi)皮細胞抗氧化能力降低并產(chǎn)生大量反應活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),引起內(nèi)皮氧化應激損傷和細胞死亡[4-5]。MicroRNAs是一類存在于真核生物中的非編碼單鏈小分子RNA,參與調(diào)控機體多種病理生理過程,包括血管穩(wěn)態(tài)[6-8]。MicroRNA-182-5p(miR-182-5p)在內(nèi)皮細胞中有很高的表達水平,但其在高糖誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激和死亡中作用尚不明確[9]。本研究通過建立高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷模型,旨在探討miR-182-5p對高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷的作用及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)購自美國ATCC公司;miR-182-5p的mimic、inhibitor及其對照,SIRT1小干擾RNA(Small interfering RNA against SIRT1,siSIRT1)購自廣州銳博生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自日本東仁化學科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(正常糖5.5 mmol/L和高糖25 mmol/L)、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶溶液購自美國GIBICO公司;總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,Gpx)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測試劑盒和2′, 7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)購自上海碧云天公司;3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、SIRT1抗體、β-actin抗體購自英國Abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞典Roche公司。

    1.2 實驗分組 HUVECs在正常糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,經(jīng)饑餓處理12 h后隨機分為5組:對照組細胞換含有19.5 mmol/L甘露醇的正常糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,高糖+mimic對照組細胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時加入mimic對照試劑培養(yǎng)24 h,高糖+mimic組細胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時加入mimic試劑(50 nmol/L)培養(yǎng)24 h,高糖+inhibitor對照組細胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時加入inhibitor對照試劑培養(yǎng)24 h,高糖+inhibitor組細胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)并同時加入inhibitor試劑(50 nmol/L)培養(yǎng)24 h。為敲低內(nèi)皮SIRT1表達,細胞先在無血清培養(yǎng)基中用siSIRT1轉(zhuǎn)染試劑(50 nmol/L)處理24 h[10-12]。

    1.3 酶活性、3-NT和MDA水平檢測 細胞SOD、CAT、Gpx、Caspase-3、LDH酶活性,3-NT和MDA水平檢測均參照試劑盒說明書進行。

    1.4 CCK-8檢測 細胞接種到96孔板并完成相應刺激后,換無血清培養(yǎng)基并加入10 μL/孔CCK-8試劑,將細胞放回37 °C培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育2 h,隨后用酶標儀檢測450 nm處吸光度值,每組設(shè)置5個復孔[13]。

    1.5 細胞內(nèi) ROS水平檢測 細胞刺激完成后換無血清培養(yǎng)基并加入5 μmol/L的DCFH-DA繼續(xù)培養(yǎng)30 min,用PBS洗滌3遍后在激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為525 nm的酶標儀下檢測[14]。檢測過程中設(shè)置不含細胞的空白組,ROS水平(%)=(待測組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

    1.6 實時熒光定量PCR 棄細胞培養(yǎng)基加入1 mL/孔TRIzol充分裂解細胞,Nanodrop 2000c檢測RNA濃度和純度,完成逆轉(zhuǎn)錄后按下列程序反應:95 ℃預變性2 min; 95 ℃×1 min,55 ℃×1 min,72 ℃×1 min,40個循環(huán);72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參進行定量檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL-2的mRNA水平[15]。

    1.7 免疫印跡 棄細胞培養(yǎng)基加入30 μL/孔裂解液,置于搖床上充分裂解20 min。用細胞刮將裂解液刮下后,轉(zhuǎn)移到新EP管內(nèi),經(jīng)超聲裂解、離心,用BCA試劑盒校正蛋白濃度,最后煮沸變性分裝保存[16]。蛋白分離采用SDS-PAGE電泳,待蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后,經(jīng)封閉、一抗和二抗孵育,用化學掃膜儀掃描并用ImageLab軟件分析定量。

    1.8 熒光素酶報告基因檢測 將帶有SIRT1野生型(Wild Type,WT)和突變型(Mutant,MUT)的3′-UTR基因序列構(gòu)建到psi-CHECK2熒光素酶報告基因質(zhì)粒(美國Promega公司)中,隨后用脂質(zhì)體6000將其轉(zhuǎn)入內(nèi)皮細胞并同時予以mimic刺激,轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性[17]。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-182-5p在高糖刺激的內(nèi)皮細胞中表達上調(diào) 高糖刺激可增加內(nèi)皮細胞miR-182-5p表達(P<0.05),且高糖刺激24 h的內(nèi)皮細胞miR-182-5p水平和高糖刺激48 h無差異(P>0.05),見圖1。

    圖1 miR-182-5p在高糖刺激的內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)

    注:與對照組相比,①P<0.05

    2.2 miR-182-5p mimic加重高糖誘導的氧化應激,而inhibitor改善高糖誘導的氧化應激 miR-182-5p mimic處理可顯著增加高糖刺激下內(nèi)皮細胞miR-128-5p表達水平,而inhibitor處理則抑制miR-128-5p表達,見圖2。與對照組相比,高糖+mimic對照組細胞脂質(zhì)及蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和3-NT水平升高,抗氧化酶SOD、CAT和Gpx活性降低,ROS水平顯著增加;而使用mimic處理后則進一步加重高糖誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激反應(均P<0.05)。與對照組相比,高糖+inhibitor對照組細胞ROS生成也增加,抗氧化能力減弱;而使用inhibitor處理后則顯著減輕內(nèi)皮細胞氧化應激水平(均P<0.05),見表1。

    圖2 miR-182-5p的mimic和inhibitor效率檢測

    表1 各組氧化應激指標

    2.3 miR-182-5p mimic促進高糖誘導的細胞凋亡,而inhibitor減輕高糖誘導的細胞死亡 與對照組相比,高糖+mimic對照組細胞明顯損傷,表現(xiàn)為存活率降低、LDH釋放增加;而mimic處理則進一步降低細胞存活率、增加LDH釋放(均P<0.05)。與對照組相比,高糖+inhibitor組細胞存活率降低、LDH釋放增加;而inhibitor處理則顯著減輕細胞損傷(均P<0.05)。高糖刺激可增加內(nèi)皮細胞Caspase-3活性,并上調(diào)促死亡蛋白BAX和抗死亡蛋白BCL-2的mRNA比值;mimic處理加重,而inhibitor處理改善高糖誘導的細胞凋亡(均P<0.05),見表2。

    表2 各組細胞存活指標

    2.4 miR-182-5p通過SIRT1發(fā)揮對內(nèi)皮細胞的調(diào)控作用 在高糖刺激的內(nèi)皮細胞中,miR-128-5p mimic可減少SIRT1蛋白水平,而inhibitor處理則增加SIRT1蛋白表達(P<0.05),見圖3。inhibitor處理改善高糖誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激和細胞死亡;與高糖+inhibitor+siRNA組相比,高糖+inhibitor+siSIRT1組細胞ROS水平、氧化應激產(chǎn)物MDA和3-NT生成增加,LDH釋放量也增多,而細胞存活率顯著降低,即沉默SIRT1阻斷miR-128-5p inhibitor介導的內(nèi)皮保護效應(均P<0.05),見表3。

    圖3 miR-182-5p對SIRT1蛋白表達影響

    表3 各組氧化應激和細胞存活指標

    2.5 miR-182-5p直接結(jié)合到SIRT1的3′-UTR TargetScan軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-182-5p可直接結(jié)合到SIRT1的3′-UTR,見圖4A。熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn),miR-182-5p mimic處理抑制攜帶WT報告基因的熒光素酶活性(P<0.05),而對MUT組活性沒有影響(P>0.05),見圖4B。

    圖4 miR-182-5p直接結(jié)合到SIRT1的3′-UTR

    3 討論

    內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管病變的關(guān)鍵病理、生理過程。在長期高糖刺激下,內(nèi)皮細胞抗氧化能力減弱,ROS大量堆積從而促進脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等重要生物大分子發(fā)生氧化性損傷,誘發(fā)細胞死亡[2]。本研究發(fā)現(xiàn),高糖刺激可降低內(nèi)皮細胞抗氧化酶活性,細胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子氧化產(chǎn)物增加;相應地,高糖組內(nèi)皮細胞LDH釋放量增加、細胞存活率降低且凋亡比例顯著增加。使用miR-182-5p mimic可加重高糖誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激和細胞死亡,而inhibitor處理則發(fā)揮顯著的內(nèi)皮保護效應。此外,軟件預測結(jié)合熒光素酶實驗證實miR-182-5p可直接結(jié)合到SIRT1的3′-UTR并抑制其蛋白表達,miR-182-5p inhibitor處理則恢復內(nèi)皮細胞SIRT1水平。

    SIRT1是Sirtuins家族重要成員,屬于Ⅲ類組蛋白去乙?;?,在細胞增殖、分化、衰老和腫瘤發(fā)生等方面均有重要調(diào)控作用[18-19]。既往研究提示,SIRT1具有顯著的抗氧化和細胞保護作用[20]。Matsui 等[21]發(fā)現(xiàn),SIRT1活化可增加抗氧化轉(zhuǎn)錄因子NRF2蛋白表達和核聚集,從而增加細胞抗氧化活性。SIRT1可促進FoxO因子入核調(diào)控抗氧化酶SOD2轉(zhuǎn)錄[22]。此外,SIRT1可促進凋亡相關(guān)蛋白p53去乙?;?,從而抑制其促凋亡活性;而抑制SIRT1則增加p53活性,促進凋亡發(fā)生[23-24]。SIRT1在內(nèi)皮細胞中也有大量表達,Li等[25]發(fā)現(xiàn)高糖刺激可明顯抑制內(nèi)皮細胞SIRT1表達,同時伴有氧自由基大量生成和內(nèi)皮功能障礙。敲低內(nèi)皮SIRT1可增加糖尿病小鼠內(nèi)皮細胞ROS生成,加重內(nèi)皮損傷和功能障礙;而SIRT1內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠在建立糖尿病模型后則表現(xiàn)出較低的氧化應激水平和內(nèi)皮損傷程度[26-27]。Fan等[28]近來研究發(fā)現(xiàn),激活SIRT1可減輕內(nèi)皮氧化應激損傷,促進內(nèi)皮存活和血管生成,從而改善糖尿病小鼠后肢缺血性損傷。本研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-182-5p可通過激活SIRT1改善高糖誘導的內(nèi)皮氧化應激和細胞死亡,而沉默SIRT1則阻斷這種內(nèi)皮保護效應。因此,SIRT1是調(diào)控糖尿病內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵靶點。

    MicroRNAs是一類長約19~24個核苷酸的非編碼RNA,常通過堿基互補配對方式與靶基因3’-UTR上種子區(qū)域完全或部分結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達[6]。近來研究提示,microRNAs參與調(diào)控細胞氧化應激和死亡等過程。Xu等[29]研究發(fā)現(xiàn),miR-626可激活KEAP1-NRF2抗氧化信號通路減輕視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化性損傷。La等[30]研究提示,高糖刺激在誘導氧化應激反應的同時伴有miR-21表達上調(diào);進一步研究證實,miR-21可抑制多種抗氧化分子表達,而使用miR-21抑制劑則減輕高糖誘導的內(nèi)皮損傷。既往有關(guān)miR-182-5p的研究大多局限在腫瘤領(lǐng)域,但越來越多研究提示,miR-182-5p在正常組織細胞的病理生理過程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[31]。Guzzolino等[32- 33]發(fā)現(xiàn),miR-182-5p在心臟組織中有較高表達水平,參與調(diào)控心臟發(fā)育和電活動,并可調(diào)節(jié)心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。過表達miR-182-5p還可抑制腫瘤壞死因子誘導的氣道平滑肌細胞增殖遷移,從而參與哮喘的氣道重構(gòu)過程;miR-182-5p還是特發(fā)性肺纖維化的重要生物標志物,抑制miR-182-5p可緩解肺纖維化進展[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-182-5p在高糖刺激的內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)并抑制SIRT1蛋白表達,從而加重內(nèi)皮氧化應激損傷和細胞死亡;而抑制miR-182-5p可恢復內(nèi)皮SIRT1水平并發(fā)揮內(nèi)皮保護效應。本研究揭示了miR-182-5p在高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷中的作用,并證明miR-182-5p是通過結(jié)合SIRT1的3′-UTR抑制其蛋白表達,從而促進高糖誘導的內(nèi)皮氧化應激和細胞凋亡;為臨床治療糖尿病內(nèi)皮損傷和血管病變提供新的理論依據(jù)。

    4 結(jié)論

    高糖刺激增加內(nèi)皮miR-182-5p表達,抑制miR-182-5p可恢復內(nèi)皮SIRT1水平,從而減輕高糖誘導的內(nèi)皮氧化應激損傷和細胞凋亡;而增加miR-182-5p則降低SIRT1表達,進一步加重高糖誘導的內(nèi)皮損傷。靶向miR-182-5p可為糖尿病內(nèi)皮損傷和血管并發(fā)癥提供新策略。

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