BEX2介導(dǎo)細(xì)胞自噬通路與小鼠結(jié)腸癌的分級、療效及預(yù)后的相關(guān)性

谷雅川 孫雪花 宋立云

結(jié)腸癌(colorectal cancer,CRC)作為消化道常見的惡性腫瘤，在全球各個(gè)國家均具有較高的發(fā)病率和病死率。結(jié)腸癌患者的治療和預(yù)后直接受到結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、浸潤以及轉(zhuǎn)移侵襲的影響[1-2]，因此，盡早的診斷出結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲，從而針對性地進(jìn)行預(yù)防、治療結(jié)腸癌，可改善患者預(yù)后[3-4]。本研究通過檢測 BEX2介導(dǎo)細(xì)胞自噬通路在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并分析結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲與BEX2的相關(guān)性，并評價(jià)其介導(dǎo)細(xì)胞自噬通路與小鼠結(jié)腸癌的分級、療效及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 小鼠結(jié)腸癌模型構(gòu)建

選取60只SD小鼠，均進(jìn)行二甲肼頸背部皮下注射，注射頻率1次/周，連續(xù)5周，建立結(jié)腸癌小鼠模型，并給予奧沙利鉑15 mg/kg，腹腔注射，每周2次，連續(xù)給藥8周。

1.2 免疫組化檢測

將小鼠病理切片標(biāo)本取出，用含有5%血清的室溫封閉40 min，然后在4 ℃情況下加入單克隆抗體BEX2、LC3-Ⅱ和堿性磷酸酶二抗孵育。利用PBS清洗再加入SP，和DAB恒溫顯色封片。BEX2、LC3-Ⅱ的主要陽性表達(dá)細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤10為陰性表達(dá)；>10為陽性表達(dá)。

1.3 Real-Time PCR檢測方法

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中的LC3-Ⅱ以及BEX2mRNA表達(dá)采用Real-time PCR法檢測。取相對定量法以及閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)值比較法，算出不同樣本間LC3-Ⅱ、BEX2、mRNA相對百分比。

1.4 WesternBlot檢測方法

將小鼠結(jié)腸癌組織收集后再提取蛋白，測定蛋白的濃度。然后利用10%聚丙烯酰胺凝膠將不同組別的蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用脫脂奶粉對PVDF膜進(jìn)行40 min封閉，加入LC3-Ⅱ、BEX2一抗過夜。1天后取出PVDF膜，用TBST洗膜，再加入二抗孵育60 min。用TBST洗膜2次。最后加入ECL顯色液顯色，掃描各泳道條帶的灰度，利用軟件計(jì)算其對應(yīng)的蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0軟件處理本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，說明數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

正常組織BEX2的陽性率為18.33%(11/60)，而結(jié)腸癌組織中則為75.00%(45/60)，結(jié)腸癌組織中表達(dá)較正常組織明顯上升(χ2=38.71,P<0.05)。LC3-Ⅱ在結(jié)腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為26.67%(16/60 )和66.67%(40/60)，結(jié)腸癌組織中LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯較正常組織下降(χ2=19.29,P<0.05)。小鼠治療后的結(jié)腸癌組織中的平均BEX2光密度明顯較治療前下降；而平均LC3-Ⅱ光密度明顯較治療前升高(P<0.05)。見表1。

表1 免疫組化蛋白光密度檢測結(jié)果

2.2 Real-Time PCR檢測BEX2和LC3-Ⅱ mRNA結(jié)果

小鼠結(jié)腸癌組織中的BEX2 mRNA表達(dá)較正常結(jié)腸組織顯著升高，而LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)含量顯著降低(P<0.05)。小鼠治療后的結(jié)腸癌組織中的BEX2 mRNA表達(dá)量明顯較治療前下降；而LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)量明顯較治療前升高(P<0.05)。見表2。

表2 Real-Time PCR檢測結(jié)果

2.3 WesternBlot檢測BEX2和LC3-Ⅱ蛋白含量結(jié)果

小鼠結(jié)腸癌組織中的BEX2蛋白表達(dá)較正常結(jié)腸組織顯著升高，而LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)含量顯著降低(P<0.05)。小鼠治療后的結(jié)腸癌組織中的BEX2蛋白表達(dá)量明顯較治療前下降；而LC3-Ⅱ蛋白量明顯較治療前升高(P<0.05)。見表3。

表3 WesternBlot檢測結(jié)果

2.4 BEX2和LC3-Ⅱ與結(jié)腸癌臨床特征、療效和預(yù)后的相關(guān)性

LC3-Ⅱ以及BEX2的陽性表達(dá)與結(jié)腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Dukes分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈現(xiàn)顯著相關(guān)性 (P<0.05)。見表4。

表4 BEX2和LC3-Ⅱ與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性/只

3 討論

BEX2 作為BEX家族的成員，主要發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、增殖等信號(hào)通路的作用[5-6]。近年來，越來越多的研究證明了BEX2與腫瘤發(fā)生具有相當(dāng)密切的關(guān)系，且在不同類型的腫瘤中發(fā)揮的作用并不相同。目前，關(guān)于結(jié)直腸癌組織中BEX2發(fā)揮何種功能尚未見報(bào)道。深入分析BEX2在結(jié)直腸癌中作用機(jī)制不僅能夠進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展生物學(xué)特征，亦可為結(jié)直腸癌患者治療提供新的靶點(diǎn)。有證據(jù)表明BEX2可以抑制線粒體凋亡。BEX2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期呈正相關(guān)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)BEX2可通過NF-kB信號(hào)通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲，克隆形成能力和致瘤能力，抑制BEX2表達(dá)在體外和體內(nèi)都能抑制腫瘤的生長[7-8]。細(xì)胞的自噬類似于細(xì)胞衰老、凋亡，作為細(xì)胞生命周期中的重要生物學(xué)環(huán)節(jié)之一，該過程在生物的生長、發(fā)育過程中普遍存在。異常的細(xì)胞自噬現(xiàn)象會(huì)造成癌細(xì)胞的發(fā)生。自噬是一種所謂的“自噬”細(xì)胞機(jī)制，它涉及清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，防止錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器的毒性積累，并通過實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的新陳代謝需求來實(shí)現(xiàn)自我吞噬[9-10]。最近的研究表明，不同類型的癌細(xì)胞在抗癌治療后會(huì)經(jīng)歷自噬，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。因此，由BEX2介導(dǎo)自噬現(xiàn)象越來越受到人們的關(guān)注。

本研究結(jié)果表明，BEX2在結(jié)腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為75.00%(45/60)和18.33%(11/60)，BEX2在結(jié)腸癌的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)。小鼠治療后的結(jié)腸癌組織中的平均BEX2光密度、BEX2蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯較治療前下降(P<0.05)。說明，BEX2可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長傳遞持續(xù)性促有絲分裂信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增殖和分裂。BEX2的陽性表達(dá)和結(jié)腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、Dukes分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)性顯著(P<0.05)，說明BEX2異常高表達(dá)和腫瘤的浸潤、分期、轉(zhuǎn)移以及治療預(yù)后等行為密切相關(guān)。LC3-Ⅱ基因是介導(dǎo)細(xì)胞自噬的主要蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的過程，并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，LC3-Ⅱ在結(jié)腸癌組織及正常組織中的陽性率分別為66.67%(40/60)和26.67%(16/60)，LC3-Ⅱ在結(jié)腸癌的表達(dá)明顯低于正常組織，說明LC3-Ⅱ表達(dá)的降低或突變與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。說明自噬可能是在腫瘤進(jìn)展的早期阻礙腫瘤發(fā)生，自噬的缺陷會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)定的能力，從而活化癌基因，讓抑癌基因失活，細(xì)胞中積累了大量的衰老細(xì)胞器，從而將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴徽５陌┘?xì)胞。本研究結(jié)果顯示LC3-Ⅱ和小鼠結(jié)腸癌浸潤深度、分化程度、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，說明浸潤深、高分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者 LC3-Ⅱ 表達(dá)異常升高。

小鼠結(jié)腸癌組織中BEX2、LC3-Ⅱ異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預(yù)測結(jié)腸癌分級、療效及預(yù)后的分子生物學(xué)靶點(diǎn)。