制備并初步評(píng)價(jià)KGDS靶向活化血小板納米釓對(duì)比劑

郭惠莊，羅文峰，余盛龍，李 莉，陳漢威

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像研究所,廣東 廣州 511400)

動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成指在動(dòng)脈粥樣硬化緩慢發(fā)展過(guò)程中斑塊突然破裂引起急性血栓形成，可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如急性冠脈綜合征、短暫性腦缺血發(fā)作和卒中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約每3例死亡事件中，即有1例死于動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成[1]。分子影像學(xué)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅猛，與傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)相比，能于組織和細(xì)胞水平反映疾病的病理過(guò)程，動(dòng)態(tài)顯示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)及成分變化，并可用于判斷預(yù)防和治療效果。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中，血小板是血栓形成的關(guān)鍵，不僅與脈管血栓閉塞終點(diǎn)事件相關(guān)，也與斑塊發(fā)展的早期階段存在密切關(guān)聯(lián)。對(duì)聚集或黏附血小板進(jìn)行成像，可更好地顯示粥樣硬化斑塊破裂形成血栓[2-4]。鐵蛋白分子在生物體內(nèi)普遍存在，具有納米級(jí)球形空腔及很好的生物相容性，非常適于作為藥物載體[5]。本實(shí)驗(yàn)嘗試以去鐵鐵蛋白為載體，將MR對(duì)比劑裝載于其內(nèi)部，在其表面連接具有靶向活化血小板功能的賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(Lys-Gly-Asp-Ser, KGDS)多肽，制備靶向活化血小板表面受體GPⅡb/Ⅲa的MR納米對(duì)比劑(Gd-Afn-KGDS)，并初步觀察其體外靶向能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 去鐵鐵蛋白(Apoferritin，Sigma)，異硫氰酸酯(FITC，Sigma)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，Sigma)，KGDS多肽(Abbiotec)，二磷酸腺苷(ADP，Sigma)，透析袋(截留分子量：8000～14000，源葉)。

1.2 儀器與設(shè)備 馬爾文粒徑分析儀(Malvern，Zetasizer Nano S90，英國(guó))，透射電子顯微鏡(FEI，Tecnai G2 F20，美國(guó))，熒光顯微鏡(Leica，DMi8-M，德國(guó))，蛋白定量?jī)x(Thermo Fisher，NanoDrop 2000，美國(guó))，原子吸收光譜儀(Thermo Fisher，ICE 3500，美國(guó))；Siemens, MAGNETOM Avanto MR儀(德國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-Rad，i-Mark，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備與純化Gd-Afn-KGDS 取5 mg/ml去鐵鐵蛋白，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，室溫孵育15 min；稱量0.093 8 g Gd-DOPA并緩慢加入上述溶液，待其完全溶解后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4，室溫?cái)嚢? h后，4 000 rpm離心5 min除去白色沉淀，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)(pH 7.4)透析24 h，得到Gd-Afn溶液，4℃保存?zhèn)溆肹6]。

取1 mg KGDS粉末溶于0.5 ml的PBS，加入22 mg EDC和12 mg NHS攪拌活化90 min，在活化好的KGDS溶液中緩慢滴入Gd-Afn溶液2 ml，冰水浴攪拌反應(yīng)過(guò)夜。將所得溶液裝入透析袋，用PBS(pH 7.4)透析24 h，最后過(guò)0.22 μm孔徑的濾膜，制得Gd-Afn-KGDS，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取Gd-Afn溶液和Gd-Afn-KGDS溶液各2 ml，分別加入黑色避光EP管中，向每管內(nèi)加入0.2 mg FITC，避光孵育12 h。將所得溶液裝入透析袋，用PBS(pH 7.4)避光透析24 h，得到FITC標(biāo)記的Gd-Afn溶液(Gd-Afn-FITC )和FITC標(biāo)記的Gd-Afn-KGDS溶液(Gd-Afn-KGDS-FITC)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Gd-Afn-KGDS特性表征 以透射電鏡觀察Gd-Afn-KGDS的納米結(jié)構(gòu)及分布，馬爾文粒徑分析儀檢測(cè)Gd-Afn-KGDS的粒徑大小及分布；將Gd-Afn-KGDS用于體外MR成像，并分析其T1增強(qiáng)效果。

1.3.3 測(cè)試Gd-Afn-KGDS細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC，由廣東省臍帶血庫(kù)提供)，以胰酶消化后重懸計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至8.0×104/ml。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸浮液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，加入不同濃度Gd-Afn-KGDS溶液，在6、12 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)取出96孔板，棄培養(yǎng)液，并以無(wú)菌PBS小心沖洗數(shù)次，每孔加入100 μl的新鮮培養(yǎng)液，并加入10 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(OD)值[7]，按下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)：RGR(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/OD對(duì)照組×100% 。

1.3.4 檢測(cè)Gd-Afn-KGDS血小板靶向能力 取6周齡(300±20)g雄性SD大鼠新鮮抗凝血液(購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中學(xué))，抗凝劑與血液比例為1∶9，800 rpm離心5 min，取上層血漿，以3 000 rpm離心10 min，棄上清，加入生理鹽水以3 000 rpm離心洗滌3次留沉淀。于37℃下靜置30 min，分離純化后得到血小板溶液。所有操作均在室溫下進(jìn)行，pH 7.4。

實(shí)驗(yàn)組：取100 μl血小板溶液，加入20 μl ADP活化血小板，同時(shí)加入120 μl Gd-Afn-KGDS-FITC，避光孵育5 min，之后在熒光顯微鏡下觀察活化血小板與Gd-Afn-KGDS的結(jié)合情況。對(duì)照組為Gd-Afn-FITC與未經(jīng)活化的血小板共孵育5 min[8]。

1.3.5 觀察Gd-Afn-KGDS體外血栓靶向能力 取6周齡(300±20)g雄性SD大鼠(購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中學(xué))新鮮血液100 μl，自然狀態(tài)下形成凝血塊，將凝血塊轉(zhuǎn)移至生理鹽水中，實(shí)驗(yàn)組加入100 μl Gd-Afn-KGDS-FITC，對(duì)照組加入Gd-Afn-FITC，避光孵育5 min，之后用生理鹽水沖洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察體外血栓與Gd-Afn-KGDS-FITC和Gd-Afn-FITC結(jié)合情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料用±s表示，以t檢驗(yàn)比較其差異；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，以單因素方差分析比較其差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gd-Afn-KGDS基本特性 所制Gd-Afn-KGDS為無(wú)色透明狀溶液，透射電鏡下呈球形，結(jié)構(gòu)完整，粒徑均一，為10～15 nm，Gd螯合物被包裹在鐵蛋白空腔內(nèi)。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析儀檢測(cè)，納米顆粒水合粒徑為(11.0±1.2)nm。T1WI顯示，隨Gd-Afn-KGDS溶液濃度增加，T1信號(hào)逐漸增強(qiáng)，Gd-Afn-KGDS T1增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度與同等濃度釓噴酸葡胺無(wú)明顯差異(t=0.387，P=0.835)；分別利用電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)和BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)所制Gd-Afn-KGDS中Gd濃度和去鐵鐵蛋白濃度，換算得出單位體積中Gd含量和去鐵鐵蛋白含量，最終通過(guò)二者比值計(jì)算得出每個(gè)去鐵鐵蛋白包載Gd原子個(gè)數(shù)平均值為17.07(即包封率=17.07個(gè)釓/去鐵鐵蛋白)。見圖1。

2.2 Gd-Afn-KGDS的細(xì)胞毒性 不同濃度Gd-Afn-KGDS與HUVEC共培養(yǎng)48 h后，HUVEC的RGR均在>85%，當(dāng)Gd-Afn-KGDS濃度<200 μg/ml時(shí)，HUVEC的 RGR>95%，Gd-Afn-KGDS對(duì)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)分級(jí)為1級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性，生物相容性良好。見圖2。

圖2 Gd-Afn-KGDS對(duì)HUVEC的細(xì)胞毒性圖

2.3 Gd-Afn-KGDS血小板靶向能力 白光條件下，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未出現(xiàn)熒光；實(shí)驗(yàn)組絕大多數(shù)血小板經(jīng)活化后發(fā)生團(tuán)聚形成微小斑塊，而對(duì)照組血小板形態(tài)正常、分散均勻，團(tuán)聚率低。488 nm激光激發(fā)下，實(shí)驗(yàn)組可見大量綠色熒光集中于活化血小板聚集而成的微小斑塊上；對(duì)照組可見部分微弱熒光點(diǎn)，為制備過(guò)程中少量血小板被活化而團(tuán)聚形成的微小斑塊。見圖3。

圖3 Gd-Afn-KGDS特異性靶向活化血小板能力顯微成像圖

2.4 Gd-Afn-KGDS體外血栓靶向能力 熒光顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組可見凝血塊發(fā)出強(qiáng)烈熒光信號(hào)，范圍與凝血塊形態(tài)基本一致；對(duì)照組凝血塊未見明顯熒光信號(hào)。見圖4。

圖4 Gd-Afn-KGDS體外特異性靶向血栓模型能力分析圖

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血栓形成對(duì)人類健康的嚴(yán)重危害日益凸顯，但迄今仍缺乏能夠客觀量化評(píng)價(jià)血栓的指標(biāo)，使現(xiàn)有診療措施帶有很大盲目性。目前影像學(xué)主要通過(guò)間接方法檢測(cè)血栓，并不能直接檢測(cè)血塊。利用分子影像學(xué)方法，可特異性以血栓為靶向，于存在粥樣硬化斑塊處檢測(cè)血凝塊。正常血液循環(huán)中，血小板處于靜息狀態(tài)；血管內(nèi)皮損傷或粥樣斑塊破裂時(shí)，血小板由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，此為血栓發(fā)生、發(fā)展

的中心環(huán)節(jié)。對(duì)活化血小板進(jìn)行成像是診斷早期血栓形成的有效途徑。GPⅡb/Ⅲa是活化血小板特異分子靶點(diǎn)，而KGDS能特異性結(jié)合GPⅡb/Ⅲa；設(shè)想通過(guò)該受體可實(shí)現(xiàn)靶向顯像活化血小板。

本研究成功制備出特異性靶向活化血小板表面受體GPⅡb/Ⅲa的MR納米對(duì)比劑Gd-Afn-KGDS，呈球形結(jié)構(gòu)，粒徑(11.0±1.2)nm，粒徑均一，與去鐵鐵蛋白無(wú)明顯差異。體外T1WI顯示，隨Gd-Afn-KGDS溶液濃度增加，T1WI信號(hào)逐漸增強(qiáng)，且其信號(hào)增強(qiáng)程度與同等濃度釓噴酸葡胺無(wú)明顯差異。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，Gd-Afn-KGDS無(wú)細(xì)胞毒性，生物相容性良好，且能特異性與活化血小板結(jié)合。

本研究利用Gd-Afn-KGDS實(shí)現(xiàn)了體外靶向顯像活化血小板，俟其成功用于臨床，將有利于提高對(duì)早期血栓的診斷能力。后續(xù)研究將致力于證實(shí)Gd-Afn-KGDS對(duì)活化血小板的體內(nèi)靶向性，并監(jiān)測(cè)其靶向顯像效果；在納米載體內(nèi)進(jìn)一步包裹溶栓藥物，賦予其溶栓特性，從而構(gòu)建診療一體化的納米藥物體系，實(shí)現(xiàn)通過(guò)分子成像實(shí)時(shí)了解治療過(guò)程藥物分布及吸收情況。