金花茶花浸提物與消化蛋白酶的相互作用

吳清孝,張海龍,秦小明,2*,諶素華

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東 湛江,524008) 2(廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,廣東 湛江,524008)

作為三大產(chǎn)能物質的蛋白質、脂肪和碳水化合物在人體代謝過程中是相互聯(lián)系、彼此影響的,當減少其中一種能量物質的攝入時,機體必須通過攝入其他兩種能量物質獲得熱量補充[1]。無論哪種產(chǎn)能物質,當攝入量超過機體的正常消耗量時,多余的能量就會轉化成脂肪儲存在體內,可能導致肥胖,同時引起心腦血管疾病、Ⅱ型糖尿病以及消化系統(tǒng)疾病等多種慢性疾病[2]。目前,通過高蛋白飲食代替高脂肪或高碳水化合物飲食逐漸成為膳食減重策略之一,然而,長期的高蛋白飲食會導致肝臟和血清中甘油三酯含量增加[3-4]。因此,有必要通過抑制多余蛋白質的消化吸收來降低過度攝入高蛋白造成的不良影響。

胃蛋白酶和胰蛋白酶在蛋白質的消化吸收過程中占主導地位,因此常作為目標酶去探究小分子化合物對蛋白質消化吸收的影響。LIU等[5]以消化蛋白酶為目標酶研究了兒茶素對乳蛋白生物活性和生物利用度的影響；WANG等[6]研究發(fā)現(xiàn),苦丁茶葉中的苯丙素苷粗提物通過改變胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的極性和結構抑制酶的活性。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),金花茶花提取物對胰腺脂肪酶、膽固醇酶、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有潛在的活性抑制,且能有效的降低餐后血糖和脂肪的攝入[7-8],但金花茶花浸提物對蛋白質消化酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)活性的影響研究尚未見報道。本文探究了金花茶花浸提物對消化蛋白酶活性的影響及其機制,以期為金花茶花的科學開發(fā)和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶花,廣西防城港市嫦龍金花茶種植園圃。

胃蛋白酶(豬胃黏膜)、茶多酚(tea polyphenol, TP)、Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(Na-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilidehydrochloride, BAPNA)、1 mol/L福林酚,上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶(豬胰臟)、三氯乙酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris),上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

N-1100V-W全自動旋轉蒸發(fā)儀,東京理化器械株式會社；FDU-1100 冷凍干燥機,東京理化器械株式會社；Cary 100紫外可見分光光度計,美國安捷倫公司；Varioskan Flash 多功能酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司；RF-5301PC 熒光光譜儀,德國BRUKER光譜儀器公司；Chirascan 圓二色光譜儀,英國應用光物理公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 金花茶花浸提物的制備

金花茶花浸提物分為乙醇提物(CamellianitidissimaChi flower ethanol extract,CNEE)和水提物(CamellianitidissimaChi flower aqueous extract,CNAE),參考ZHANG等[8]的方法,并稍作修改。乙醇提物提取條件：稱取100 g粉碎后的金花茶花并按照料液比1∶25(g∶mL)加入2.5 L 體積分數(shù)為50%的乙醇,在55 ℃下浸提5 h,8 000 r/min離心30 min后收集浸提液,重復浸提2次,混合,在37 ℃下旋轉蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥得到醇粗提物。水提物提取條件：稱取100 g金花茶花粉末,按料液比1∶30(g∶mL)加入3 L蒸餾水,在90 ℃下浸提2 h,后續(xù)操作與醇粗提物相同,得到水粗提物。用XAD1600大孔樹脂純化粗提物,分別收集醇提物和水提物洗脫液,然后經(jīng)旋轉濃縮和冷凍干燥后獲得了CNEE和CNAE用于后續(xù)實驗。

1.3.2 抑制率實驗

胃蛋白酶的抑制實驗參考ZENG等[9]的方法并稍作修改。不同濃度的金花茶花提取物與胃蛋白酶在37 ℃反應30 min,加入牛血紅蛋白繼續(xù)反應10 min,再加入適量三氯乙酸,以12 000 r/min離心10 min,收集沉淀用堿性銅溶液溶解,并加入福林酚溶液進行顯色反應,測A650 nm值。

胰蛋白酶的抑制實驗參考FENG等[10]方法并做修改。不同濃度的金花茶花提取物與胰蛋白酶在37 ℃下反應30 min,再加入BAPNA溶液,反應10 min后,加入適量的三氯乙酸終止反應,測定A410nm值。胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制率計算如公式(1)所示：

胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制率/%=

(1)

1.3.3 抑制動力學研究

參考WANG等[6]的方法對胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制動力學進行探究。

1.3.3.1 提取物對胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制動力學

不同濃度的金花茶花浸提物與胃蛋白酶等體積混合在37 ℃下反應30 min,然后加入不同質量濃度(6、7、8、9、10 g/L)的牛血紅蛋白溶液,在650 nm處測定其吸光度值。

不同濃度的金花茶花浸提物與胰蛋白酶等體積混合在37 ℃下反應30 min,然后加入不同質量濃度(2、4、6、8、10 g/L)的BAPNA溶液,在410 nm處測定吸光度值。

抑制類型采用Lineweaver-Burk[11]方程解析,以1/v和1/[S]作圖,根據(jù)公式(2)計算：

(2)

式中：v和vmax分別為初始反應速度和最大初始反應速度；Km、Ki、K′i分別為米氏常數(shù)、競爭抑制常數(shù)和非競爭抑制常數(shù)；[I],抑制劑的濃度, g/L；S為底物的質量濃度,g/L。

1.3.4 熒光特性分析

0.1 mL不同質量濃度的CNEE或CNAE溶液和3.9 mL 0.2 g/L的胃蛋白酶或胰蛋白酶溶液迅速混合反應30 min,在激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長為290～500 nm,狹縫寬度為5 nm的條件下測定其熒光強度。熒光猝滅由Stern-Volmer[12]方程確定,如公式(3)所示：

(3)

式中：F0,未加入CNEE或CNAE的熒光強度；F,已加入CNEE或CNAE的熒光強度；Kq和KSV為生物分子猝滅常數(shù)和猝滅常數(shù)；τ0為熒光團的生命周期(無猝滅劑)；[Q]為CNEE或CNAE的質量濃度,g/L。

1.3.5 紫外可見吸收光譜測定

設置3個實驗組,第1組為消化蛋白酶組,分別加入質量濃度為5 g/L不同體積(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL)的胃蛋白酶或胰蛋白酶,加入酸溶液或Tris-HCl溶液補充至4 mL。第2組為金花茶花浸提物組,分別加入質量濃度為1 g/L的不同體積(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL)的CNEE或CNAE,再加入酸溶液補充至4 mL。第3組為金花茶花浸提物+消化蛋白酶組,將0.45 mL 5 g/L的胃蛋白酶和0.7 mL 1 g/L的CNEE或0.8 mL 1 g/L的CNAE混合；1 mL 5 g/L胰蛋白酶和0.1 mL 1 g/L的CNEE或0.15 mL 1 g/L的CNAE混合。在掃描波長范圍為190～500 nm,掃描精度為1.0 nm,測試溫度為298 K的條件下測定溶液的紫外光譜。根據(jù)實驗結果進行分析,做出(金花茶花浸提物+消化蛋白酶)-金花茶花浸提物的紫外圖譜,并分析曲線差異。

1.3.6 二級結構的測定

采用圓二色譜法分析金花茶花浸提物與消化蛋白酶反應前后二級結構的變化。金花茶花浸提物與胃蛋白酶和胰蛋白酶[1∶1(V/V)]以1∶1(g∶L)的比例混合，添加于5 mL離心管中,振蕩反應,在190～260 nm處掃描。

1.3.7 統(tǒng)計學分析

所有的實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0軟件處理,每次實驗重復3次,結果用平均值±標準差表示,不同組間的比較采用LSD進行方差分析,當P<0.05時表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 金花茶花浸提物對胃蛋白酶和胰蛋白酶活性的影響

由圖1-a1和b1可知,CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶都有一定的抑制作用,且抑制作用強弱順序依次為：CNEE>CNAE>TP。CNEE和CNAE對胃蛋白酶的IC50分別為3.194和3.330 g/L,其與周培羽等[13]研究的低聚合度(2.45)葡萄籽原花青素對胃蛋白酶的IC50值為3.160 g/L的結果接近。然而,CNEE和CNAE對胰蛋白酶的IC50分別為29.131和56.534 g/L,這說明CNEE和CNAE對胃蛋白酶活性的抑制能力強于胰蛋白酶。綜上可知,CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抑制作用,且CNEE對胃蛋白酶和胰蛋白酶抑制強度大于CNAE,這可能是由于CNEE中黃酮和多酚含量高于CNAE,更易與消化蛋白酶的結合。

由圖1-a2和b2可知,CNEE和CNAE抑制胃蛋白酶活性的3條曲線都交于第二象限,Vmax隨著CNEE和CNAE濃度的增加而減小,而Km值隨著CNEE和CNAE濃度的增加逐漸增大,屬于混合型抑制,且CNEE和CNAE對胃蛋白酶的競爭抑制常數(shù)分別為4.518和7.641 g/L。圖1-a3和b3所示,CNEE和CNAE抑制胰蛋白酶活性的3條曲線都交于第三象限,Vmax和Km值隨著CNEE和CNAE質量濃度的增加而減小,屬于混合型抑制,且CNEE和CNAE對胰蛋白酶的競爭抑制常數(shù)分別為74.571和175.832 g/L。上述結果表明,CNEE和CNAE與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用過程中,CNEE和CNAE可能與底物結合位點和其他活性位點競爭性相互作用。XIAO等[14]研究單寧酸與胰蛋白酶相互作用中發(fā)現(xiàn)其抑制類型為混合型抑制,與本研究結果一致。

a1-金花茶花浸提物和茶多酚對胃蛋白酶的抑制率;a2-CNEE對胃蛋白酶的抑制動力學圖;a3-CNEE對胰蛋白酶的抑制動力學圖; b1-金花茶花浸提物和茶多酚對胰蛋白酶的抑制率;b2-CNAE對胃蛋白酶的抑制動力學圖;b3-CNAE對胰蛋白酶的抑制動力學圖圖1 CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制率和雙倒數(shù)曲線Fig.1 The inhibition rate and double countdown curve of CNEE and CNAE on gastric pepsin and trypsin

2.2 CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶的熒光猝滅效應

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅2種類型[15]。如圖2-a1和b1所示,胃蛋白酶在340 nm處有最大發(fā)射波長,隨著CNEE和CNAE濃度的增加,胃蛋白酶在340 nm處的熒光強度逐漸下降,說明CNEE和CNAE與胃蛋白酶相互作用使酶結構發(fā)生了改變同時產(chǎn)生了猝滅現(xiàn)象。但是CNEE和CNAE都未改變胃蛋白酶的最大發(fā)射波長,這表明CNEE和CNAE對胃蛋白酶中色氨酸殘基的微環(huán)境沒有影響。通過公式(3)判定猝滅的類型,由圖2-a2和b2以及表1可知,CNEE和CNAE對胃蛋白酶的熒光猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高而下降,即為靜態(tài)猝滅。ZENG等[16]和REN等[17]研究也發(fā)現(xiàn),水飛薊賓和蘆薈大黃素能與胃蛋白酶形成復合物,從而降低胃蛋白酶的熒光強度,猝滅酶的內源熒光,影響酶的構象。由圖3-c1和d1可知,胰蛋白酶在337 nm處有最大發(fā)射波長,隨CNEE和CNAE濃度的增大胰蛋白酶的熒光強度下降,說明CNEE和CNAE與胰蛋白酶的相互作用使酶的結構發(fā)生了改變并產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象。由圖3-c2和d2以及表2可知,CNEE和CNAE對胰蛋白酶的熒光猝滅常數(shù)隨著溫度升高而降低,這可能是在靜態(tài)猝滅過程中,由于溫度升高,擴散速度降低,導致CNEE和CNAE與胰蛋白酶碰撞猝滅量降低,進而使熒光猝滅常數(shù)下降[18]。

圖2 CNEE和CNAE對胃蛋白酶的熒光猝滅Fig.2 Fluorescence quenching of pepsin by CNEE and CNAE.注：a1和a2為CNEE對胃蛋白酶熒光圖;b1和b2為CNAE對胃蛋白酶熒光圖; a1和b1中曲線(1→6)對應于CNEE和CNAE濃度為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L

圖3 CNEE和CNAE對胰蛋白酶的熒光猝滅Fig.3 Fluorescence quenching of trypsin by CNEE and CNAE.注：c1和c2為CNEE對胰蛋白酶熒光圖;d1和d2為CNAE對胰蛋白酶熒光圖; c1和d1中曲線(1→6)對應于CNEE和CNAE濃度為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 g/L

表1 CNEE和CNAE對胃蛋白酶的熒光猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants of CNEE and CNAE on pepsin

表2 CNEE和CNAE對胰蛋白酶的熒光猝滅常數(shù)Table 2 Stern-volmer quenching constants of CNEE and CNAE on trypsin

綜上可知,CNEE和CNAE通過靜態(tài)猝滅機制猝滅胃蛋白酶和胰蛋白酶的內源熒光。這與倪孟婷等[19]和趙紅輝[20]的研究結果一致,隨著溫度升高,猝滅常數(shù)不斷下降,槲皮素、山奈酚、芹菜素和蘆丁等均不能改變胰蛋白酶中色氨酸等微環(huán)境。

2.3 CNEE和CNAE與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用的紫外可見吸收光譜圖

由圖4-a1和a2可知,胃蛋白酶在210 nm有較強吸收峰,其體現(xiàn)了蛋白質的骨架和肽鍵結構；在280 nm處有弱吸收峰,其主要由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸引起。當CNEE和CNAE與胃蛋白酶和胰蛋白酶不發(fā)生相互作用時,曲線A(E)與曲線D(H)應大致相同[21]；然而,當CNEE或CNAE與胃蛋白酶發(fā)生相互作用后,210 nm處的峰值下降且發(fā)生小幅度紅移,說明CNEE和CNAE與胃蛋白酶發(fā)生了相互作用且猝滅類型為靜態(tài)猝滅；且280 nm處的峰值增加,這可能是由CNEE或CNAE破壞了酶的結構,增加了芳香族氨基酸親水區(qū)域的暴露。由圖4-b1和b2可知,與胃蛋白酶相比,CNEE和CNAE與胰蛋白酶相互作用后,280 nm處的峰值增加幅度較小,在210 nm處無明顯位移,這說明了CNEE和CNAE對胰蛋白酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅且CNEE和CNAE對胰蛋白酶構象影響較小。

圖4 CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶紫外光譜的影響Fig.4 Effects of CNEE and CNAE on the UV spectra of pepsin and trypsin

綜上可知,不同浸提物都改變了胃蛋白酶和胰蛋白酶的結構,猝滅類型為靜態(tài)猝滅,這與熒光光譜結果一致。REN等[17,22]在研究大黃素與胃蛋白酶和胰蛋白酶的結合特性中也發(fā)現(xiàn)大黃素改變了消化酶的構象,其對酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

2.4 CNEE和CNAE與胃蛋白酶和胰蛋白酶相互作用的圓二色譜圖

由圖5中a1、a2和表3可知,胃蛋白酶在200 nm處有一個負峰,說明胃蛋白酶含有大量的β-折疊和無規(guī)則卷曲。這與擬合結果胃蛋白酶含有35.1%無規(guī)則卷曲和35.4% β-折疊的結果一致。當CNEE與胃蛋白酶以0.25∶0.2混合后,胃蛋白酶的α-螺旋和無規(guī)則卷曲分別下降了0.4%和4.7%,且β-折疊和β-轉角分別提升了10.4%和0.7%。當CNAE與胃蛋白酶濃度比以0.25∶0.2混合后,胃蛋白酶中的α-螺旋和無規(guī)則卷曲相對于空白分別下降了0.2%和4.5%,β-折疊與β-轉角含量分別提升了8.3%和0.3%,這說明了CNEE和CNAE通過促進α-螺旋和無規(guī)則卷曲向β-折疊與β-轉角轉變而改變蛋白酶的二級結構,且CNEE對胃蛋白酶二級結構的影響大于CNAE。由圖5-b1、b2和表3可知,胰蛋白酶在195、205和222 nm處有負峰,且通過擬合可知,胰蛋白酶含有6.1%的α-螺旋,16.9%的β-轉角,29.6%的無規(guī)則卷曲和51.1%的β-折疊。當CNEE與胰蛋白酶以0.25∶1混合后,胰蛋白酶的α-螺旋和無規(guī)則卷曲分別下降了0.1%和0.7%,而β-折疊和β-轉角分別增加了1.4%和0.3%。在相同濃度下,CNEE對胰蛋白酶二級結構的影響比CNAE更顯著。當CNAE與胰蛋白酶以0.25∶1混合后,胰蛋白酶的α-螺旋和無規(guī)則卷曲分別下降了0.1%和0.4%,β-折疊和β-轉角分別增加了0.7%和0.3%。因此,CNEE對胃蛋白酶和胰蛋白酶二級結構的影響大于CNAE,更容易與酶的活性位點相結合,促使胃蛋白酶和胰

蛋白酶分子結構發(fā)生改變。劉嬋[23]研究發(fā)現(xiàn)沒食子兒茶素與胰蛋白酶相互作用后也增加了胰蛋白酶中β-折疊含量。

圖5 CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶圓二色譜的影響Fig.5 Effects of CNEE and CNAE on the circular dichroism spectra of pepsin and trypsin注：a1-CNEE對胃蛋白酶的圓二色譜的影響;a2-CNAE對胃蛋白酶的圓二色譜的影響;b1-CNEE對胰蛋白酶的圓二色譜; b2-CNAE對胰蛋白酶的圓二色譜。其中A、B、C分別表示CNEE或CNAE與胃蛋白酶的比值為0∶0.2、0.15∶0.2和0.25∶0.2；E、F、G分別表示CNEE或CNAE與胰蛋白酶的比值為0∶1、0.15∶1和0.25∶1

表3 CNEE和CNAE對胃蛋白酶和胰蛋白酶二級結構的影響Table 3 Effects of CNEE and CNAE on the secondary structure of pepsins and trypsin.

3 結論

CNEE和CNAE通過改變消化蛋白酶(酶蛋白酶和胰蛋白酶)的結構進而抑制酶的活性且為可逆的混合型抑制,其中CNEE和CNAE對胃蛋白酶的抑制作用更明顯。靜態(tài)猝滅是導致消化蛋白酶內源熒光猝滅的主要原因。CNEE和CNAE與消化蛋白酶相互作用的研究為金花茶花在保健品行業(yè)的應用提供了理論基礎。