海參酶解物促SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合效果的研究

程敏君,胡錦華,唐雪,楊亭亭,周鵬*,胡煒

1(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 3(山東好當家海洋發(fā)展股份有限公司,山東 威海,264200)

海參是藥食同源的珍貴補品,具有高蛋白、低脂肪和低糖的特點[1]。受氣候環(huán)境的影響,成熟海參的個體差異較大,較小個體的海參只能作為低值產(chǎn)品出售。隨著海參逐年上升的消費趨勢和日益擴大的養(yǎng)殖規(guī)模[2],小個體海參的高值化利用問題亟待解決。海參的個體大小與營養(yǎng)組成相關(guān)性不大[3],因此利用小個體海參開發(fā)保健食品或藥品是其高值化利用的有效途徑之一,如開發(fā)具備抗炎癥[4]、抗凝血[5]、抗真菌[6]和增強機體免疫功能[7]等功效的口服液、功能飲料和膠囊等。

目前,關(guān)于海參促傷口愈合的研究十分有限。事實上,機體在創(chuàng)面愈合過程中需要大量的營養(yǎng)底物提供創(chuàng)面處細胞的合成和能量需求[8]。海參不僅富含膠原蛋白,還富含具有調(diào)節(jié)機體炎癥反應[9]和免疫修復作用[10]的精氨酸、支鏈氨基酸以及各種微量元素,具有良好的促傷口愈合的潛力。但海參蛋白存在溶解性不佳和消化吸收性較差等問題。

本研究以小個體海參為原料,通過酶解獲得較小的分子質(zhì)量、易吸收的海參酶解物(sea cucumber hydrolysate,SCH),再開展動物實驗對其進行功效驗證,探究SCH對創(chuàng)面愈合的影響,以期為海參資源的綜合高價值利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參,無錫天鵬海鮮市場；SD大鼠(SPF級、5周齡雄性),維通利華實驗動物有限公司；風味蛋白酶(30 000 U/g)、水產(chǎn)蛋白酶(300 000 U/g),東恒華道生物科技有限責任公司；云南白藥顆粒,云南白藥集團股份有限公司；硫酸慶大霉素,敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司；大鼠白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的Elisa試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他實驗試劑均為分析純,上海生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

料理機(AD-G888),德國GUGE公司；凱氏定氮儀(SKD-200),上海沛歐分析儀器有限公司；高效液相色譜儀(Agilent 1260),美國Agilent公司；冷凍離心機(Heraeus X1R)、酶標儀(Multiskan Sky),美國Thermo Scientific 公司；冷凍干燥機(BTP),美國SP Scientific公司；一次性活檢打孔器(D=10 mm),圣諾圖穿刺器材公司；等距平衡光拍攝支架,芯鮮數(shù)碼公司；佳能單反相機(EOS 80D),日本Canon公司；生物顯微鏡(DM 2000),德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海參營養(yǎng)組成中有機物含量和氨基酸分析

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》的酸水解法測定粗脂肪含量；參考宋思暖等[11]方法提取海參粗多糖,并用苯酚-硫酸法[12]測定其含量；參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中酸水解法測定16種常見氨基酸的組成；參考DB 37/T 2094—2012《水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的測定 高效液相色譜法》測定羥脯氨酸的含量。

1.3.2 SCH制備

將鮮參洗凈棄內(nèi)臟,剪碎勻漿。勻漿物置于無菌發(fā)酵罐中,料液比為1∶4(g∶mL),加酶量10 000 U/g(水產(chǎn)蛋白酶和風味蛋白酶按照4∶6的酶活力比例混合形成復合酶),溫度52 ℃。酶解1 h后滅酶并冷卻,加入乙醇除雜[13],低溫離心,保留上清液進行旋蒸濃縮和冷凍干燥,獲得SCH備用。

1.3.3 SCH的分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相色譜法測定樣品的分子質(zhì)量分布情況,設定參數(shù)如下：色譜柱;TSK GEL 2000 SWXL (300 mm×7.8 mm)；流動相,V(含體積分數(shù)0.1%三氯乙酸的乙腈)∶V(超純水)=40∶60；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；體積10 μL；樣品質(zhì)量濃度1 mg/mL；分析配件,2487紫外檢測器和GPC分析軟件。以標準品細胞色素C(Mw=12 384 Da)、抑肽酶(Mw=6 500 Da)、桿菌酶(Mw=1 422 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451 Da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw=189 Da)為對照。

1.3.4 動物實驗分組及處理

1.3.4.1 動物實驗分組

SD雄鼠90只,分為5組(n=18),包括模型組(Vehicle)、SCH低劑量(L-SCH)、中劑量(M-SCH)、高劑量(H-SCH)組和陽性組(云南白藥顆粒,YNBY)[14]。將SCH用生理鹽水復溶,其中低、中、高劑量按照0.25、0.50和1.00 g/kg的蛋白含量進行配制[15],過0.22 μm膜,現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)云南白藥膠囊說明書推薦劑量和動物藥理試驗換算法則[16],陽性組的灌胃劑量為0.10 g/kg。以上5組每天的灌胃體積均為0.01 mL/g,模型組灌胃生理鹽水,飼養(yǎng)期間對大鼠體重進行記錄并觀察健康狀況。

1.3.4.2 全皮層切除模型的建立

檢疫期結(jié)束后適應性灌胃5～7 d。大鼠造模前禁食16 h,按35 mg/kg的注射劑量腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為1%的戊巴比妥鈉進行麻醉。除去大鼠背部毛發(fā),用醫(yī)用酒精消毒,在脊柱中部兩側(cè)的相同位置,用活檢打孔器制作圓形傷口,制備全皮層切除傷口并視為第0天。術(shù)后,所有大鼠均接受10 000單位的硫酸慶大霉素腹腔注射避免感染,同時用拍照裝置拍攝創(chuàng)面記錄。造模后第1天起,每日對大鼠進行灌胃,于第4天、第8天和第12天分批取樣(n=6)[16]。取樣前進行創(chuàng)面拍攝,心臟取血,切取兩側(cè)新生傷口組織置于液氮中,結(jié)束取樣后存于-80 ℃冰箱中備用。本次動物實驗的倫理申請經(jīng)過江南大學動物倫理委員會認可,審核編號為JN.No20191015S1051122。

1.3.5 傷口愈合率測定方法

采用等距平衡光拍攝裝置對創(chuàng)面進行拍照,并用直角尺對照記錄。用Adobe Photoshop 2020和 Image-Pro Plus 6.0軟件計算大鼠創(chuàng)面面積來計算愈合率,按公式(1)計算傷口愈合率[18]：

(1)

式中：S0,原始傷口面積,cm2；S,現(xiàn)存?zhèn)诿娣e,cm2。

1.3.6 組織切片染色分析

蘇木精伊紅染色(hematoxylin-eosin,H&E)和馬森三色染色(Masson’s trichrome method,Masson)是組織病理學常用的分析方法,常用來觀察皮膚中成纖維細胞增值、血管新生和膠原纖維排列等情況[19]。將皮膚組織用體積分數(shù)為4%的中性甲醛現(xiàn)配液固定,石蠟包埋并切片,分別進行H&E和Masson染色,在生物顯微鏡下觀察并記錄皮膚傷口的病理變化和纖維新生情況。

1.3.7 血液中炎癥因子的Elisa分析

取待測血清在冰浴中解凍,根據(jù)Elisa試劑盒使用說明書進行樣本預處理并測定IL-8和IL-10的含量。

1.3.8 組織中羥脯氨酸和生長因子的Elisa分析

取待測組織在冰浴中解凍,根據(jù)Elisa試劑盒使用說明書進行樣本預處理,測定和計算Hyp、EGF、VEGF和bFGF的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件里One-Way ANOVA方法下的LSD和Ducan’s multiple range test方法對試驗數(shù)據(jù)進行分析,用不同的字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)；用Origin 2017軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參的營養(yǎng)組成

海參營養(yǎng)組成中的有機物主要是蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗多糖。通過實驗測得,海參干基中蛋白質(zhì)占比為(49.57±0.92)%,粗脂肪為(5.16±0.26)%,粗多糖為(4.02±0.24)%,可見海參營養(yǎng)物質(zhì)中最主要的有機物為蛋白質(zhì),約占總有機物的85.00%,該結(jié)果與高菲[20]測得的結(jié)果相似,故海參是一種富含蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)海產(chǎn)品。

海參的氨基酸組成及其含量如表1所示,海參中氨基酸含量較高的依次為谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、羥脯氨酸(Hyp)和丙氨酸(Ala),這7種氨基酸可占總量的66.50%。其中,Pro和Hyp總占比可達14.80%,是膠原蛋白重要組成的氨基酸,且有文獻報道膠原蛋白是皮膚的重要組成基質(zhì)[21]。此外,Arg是條件必需氨基酸,含量為6.70%,具有調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合作用[9]；纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)是支鏈氨基酸,總含量約為15.00%,具備免疫調(diào)節(jié)和機體修復的生理功能[10]。故海參富含多種與創(chuàng)面修復相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì),是一種潛在的具有促創(chuàng)面愈合功效的食品。

表1 海參的氨基酸組成Table 1 Amino acid compositions of sea cucumber

2.2 SCH的分子質(zhì)量分布

SCH的分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖1所示, SCH的分子質(zhì)量<2 000 Da約占97.41%,其中<1 000 Da占88.70%,180～500 Da占50.80%,<180 Da占19.93%。已有研究報道,2～3個氨基酸組成的小肽吸收效率最高且生理活性最強,可通過PepT1被小腸黏膜直接吸收利用[22]。由圖1可知,經(jīng)酶解后的樣品中180～500 Da的肽段含量最高,這其中主要為二肽和三肽[23]。因此,與未酶解的海參大分子蛋白相比,SCH更易被人體消化吸收和發(fā)揮生理功效。

圖1 SCH的分子質(zhì)量分布圖Fig.1 Molecular mass distribution of SCH

2.3 SCH對SD大鼠體重的影響

通過監(jiān)測各組大鼠的體重變化,考察灌胃SCH的安全性。由圖2可知,飼養(yǎng)期間各組大鼠均在自由生長,各組間體重沒有顯著差異(P>0.05)。同時觀察到大鼠的攝食頻率、糞便情況和毛發(fā)狀態(tài)等,均無異常,表明SCH對大鼠的正常生長沒有副影響。

圖2 各組大鼠的體重變化曲線Fig.2 Body mass changing curves of rats in each group

2.4 傷口愈合率

通過監(jiān)測大鼠創(chuàng)面愈合率分析SCH促創(chuàng)面愈合的效果。由圖3-a可知,大鼠皮膚創(chuàng)面隨著時間的延長逐漸愈合,第4天創(chuàng)面均已結(jié)痂,在第12天時,肉眼可見SCH各組和陽性組的傷口面積均小于模型組,且部分出現(xiàn)了粉嫩的新生組織,尤以中劑量組最為顯著。結(jié)合圖3-b所示,第4天的SCH各組和陽性組愈合率均超過模型組,但不存在顯著性(P>0.05)；第8天中劑量組顯著高于模型組(P<0.05)；第12天低劑量組、中劑量組和陽性組顯著高于模型組(P<0.05)。說明SCH可促進創(chuàng)面愈合,且愈合速度與云南白藥組無顯著差異,尤其以中劑量組表現(xiàn)效果最佳。

a-各時間段代表性圖片；b-傷口愈合率圖3 SCH對大鼠創(chuàng)面愈合的影響Fig.3 Effect of SCH on wound healing in rats注:不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.5 H&E染色病理分析

創(chuàng)面處炎性細胞狀態(tài)、成纖維細胞增殖、血管新生和再上皮化等狀況[19]可以用H&E染色結(jié)果顯示,其結(jié)果如圖4所示。

第4天模型組表現(xiàn)出炎性細胞浸潤的特點,而SCH各組和陽性組的炎性細胞較少,且有大量血管新生；第8天,各組創(chuàng)面均上皮化,其中模型組仍有大量炎性細胞,而SCH各組和陽性組有少量毛囊和皮膚附屬器生成；第12天,SCH各組和陽性組均有大量皮膚附屬器和毛囊形成,而模型組中較少。其中,中劑量組的膠原纖維和皮膚附屬器排列緊密有序,新生表皮較薄,重塑效果優(yōu)于云南白藥組。說明SCH可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面處炎性細胞浸潤程度,促進血管新生、成纖維細胞增殖和再上皮化。

C-炎性細胞；B-血管；F-成纖維細胞；E-表皮；G-皮膚附屬器；H-毛囊圖4 第4、8、12天創(chuàng)面處H&E染色的代表性顯微鏡圖片(×100)Fig.4 Representative micrographs of H&E-stained section of wounds on day 4, 8 and 12圖中“—”表示100 μm(圖6同)

2.6 血清中炎癥因子水平

通過測定大鼠血清中炎癥因子的分泌量來表征機體的炎癥現(xiàn)象,其中IL-8可以通過促進炎性細胞浸潤[24]而延長炎癥反應,相反的,IL-10有抗炎功能[25]。如圖5所示,不同時期內(nèi)SCH組的IL-8含量均顯著低于模型組(P<0.05),IL-10含量顯著高于模型組(P<0.05),且存在劑量依賴性,這與圖4中各組的炎癥細胞浸潤結(jié)果一致。說明SCH可以調(diào)節(jié)大鼠機體的炎癥反應,從而影響創(chuàng)面愈合速度。

圖5 SCH對大鼠血清中炎癥因子的影響Fig.5 Effect of SCH on the inflammatory factors of serum from rats

2.7 創(chuàng)面膠原纖維新生情況

膠原纖維的新生是創(chuàng)面愈合所必須的,而Masson染色法可以將膠原纖維染成藍紫色[19],所以對比藍紫色的密度和深度可以判斷各時間段創(chuàng)面處膠原纖維的含量。如圖6所示,隨著時間的增加,藍色區(qū)域面積和密度越來越多,說明創(chuàng)面處新生了大量膠原纖維。第4天,SCH中、高劑量組和陽性組中藍色較模型組多；第8天,SCH各組和陽性組的膠原纖維含量明顯多于模型組；第12天,SCH各組和陽性組的膠原纖維大量合成,且對比3個SCH劑量組可知膠原纖維合成具有劑量依賴性,此外,SCH中劑量組表現(xiàn)出有序的膠原纖維排列,甚至優(yōu)于高劑量組和陽性組。

圖6 第4、8、12天創(chuàng)面處Masson染色的代表性顯微鏡圖片(×100)Fig.6 Representative micrographs of Masson-stained section of wounds on day 4, 8 and 12

2.8 創(chuàng)面羥脯氨酸水平

Hyp是膠原蛋白的特征氨基酸[21],其含量可用于分析皮膚中膠原蛋白含量。由圖7可知,在第4天,SCH各組的Hyp水平已經(jīng)顯著高于模型組(P<0.05),第8天和第12天也出現(xiàn)類似趨勢,且存在劑量依賴性。此外,圖7的結(jié)果和圖6的結(jié)果顯示相似的趨勢,表明SCH可以促進創(chuàng)面處Hyp合成分泌,促進膠原形成。

圖7 SCH對大鼠創(chuàng)面中羥脯氨酸含量的影響Fig.7 Effect of SCH on the hydroxyproline content in wound of rats

2.9 組織中生長因子水平

為探討SCH對創(chuàng)面愈合的作用機制,從而測定了創(chuàng)面處生長因子VEGF、bFGF和EGF的水平。由圖8可知：3個SCH劑量組中VEGF含量在3個時間點的表達水平均顯著高于模型組(P<0.05)；在第4天和第8天,3組SCH的EGF和bFGF的分泌量顯著高于模型組(P<0.05),其中SCH中、高劑量組在第12天的含量繼續(xù)顯著高于模型組(P<0.05)。此外,對比SCH中、高劑量組的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),除了第8天的EGF表達水平存在差異外,其余生長因子在3個時間段的表達水平不存在顯著性(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)表明,在創(chuàng)面愈合過程中,SCH可以上調(diào)創(chuàng)面處生長因子VEGF、bFEF和EGF的表達水平,且SCH中劑量組就可以達到與高劑量組相似的效果。

圖8 SCH對大鼠創(chuàng)面中生長因子含量的影響Fig.8 Effect of SCH on growth factors content in wound of rats

3 討論

皮膚的傷口愈合是一個繁雜的動態(tài)過程,需要多種組織和細胞因子協(xié)同完成,此外還需要營養(yǎng)底物供給來促進蛋白的合成。有文獻報道,羥脯氨酸、脯氨酸和精氨酸可以促進膠原合成[26],支鏈氨基酸可以促進蛋白合成和機體修復[27],小分子寡肽可以調(diào)節(jié)機體炎癥反應和促進生長因子分泌[28]。本研究證實SCH是一種富含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品,同時含有豐富的羥脯氨酸、精氨酸、脯氨酸、支鏈氨基酸和小分子寡肽,從理論上提示SCH可提供創(chuàng)面愈合的營養(yǎng)需求,可作進一步的功效驗證探索。

云南白藥是我國治療外傷的常用藥,據(jù)文獻報道,云南白藥可抑制炎癥、加速創(chuàng)面凝血,還可以促進生長因子分泌加速肉芽形成和組織重塑[29]。本研究選用云南白藥作為陽性對照,通過動物實驗對SCH的促傷口愈合功效進行驗證。創(chuàng)面愈合會經(jīng)歷4個階段,主要涉及炎性細胞浸潤、炎癥因子釋放、成纖維細胞增殖、膠原沉積、肉芽組織形成和創(chuàng)面上皮化這幾個過程[30]。本研究中H&E染色和血清中IL-8、IL-10水平的結(jié)果顯示,SCH可同時上調(diào)IL-10和下調(diào)IL-8的含量,以減少創(chuàng)面處炎性細胞的浸潤。李林等[15]發(fā)現(xiàn),海參膠原低聚肽可以通過調(diào)節(jié)IL-8和IL-10的分泌來減緩機體的炎癥反應,這與本研究的結(jié)果一致。同時有研究表明,炎癥反應主要出現(xiàn)在愈合前中期,且適當?shù)难装Y反應是有利于創(chuàng)面愈合的,因為很多生長因子來源于炎性細胞,但是過度的炎癥反應會延緩傷口愈合[31]。故對比3個劑量組和陽性組的抗炎效果,結(jié)果顯示均減緩了炎癥反應,但高劑量組的抗炎性過于激烈,甚至超過陽性組,而中劑量組顯示適中的抗炎性。此外H&E染色結(jié)果還顯示,中劑量組在愈合后期的重塑效果優(yōu)于高劑量組和陽性組,這可能與炎癥的適度調(diào)節(jié)有關(guān)。膠原是細胞外基質(zhì)的重要組分,而羥脯氨酸是膠原的特有氨基酸。WANG等[32]證實了來源于鮭魚皮的膠原肽通過促進膠原沉積加快剖宮產(chǎn)大鼠的傷口愈合。本研究中檢測了創(chuàng)面處的Hyp水平,結(jié)果可知SCH可促進膠原沉積,這可能與SCH原料中富含膠原肽有關(guān)。同時有文獻報道,在傷口愈合后期,過多的膠原沉積會造成增生性疤痕的形成[33]。本研究中Masson染色結(jié)果可見,在愈合后期,高劑量組的新生表皮較厚,而中劑量組的新生表皮薄且皮膚附屬器排列有序,說明高劑量組可能存在膠原沉積過度的現(xiàn)象,而中劑量組的膠原合成分泌量更適宜。此外,生長因子的調(diào)控是創(chuàng)面愈合中至關(guān)重要的,其各自發(fā)揮著不同的作用。VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子,具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成的作用[34]。EGF是促進細胞分裂的因子,可促進多種細胞分裂并形成肉芽組織,同時增加肉芽組織中膠原合成,對皮膚損傷有較好的促愈合作用[35]。bFGF是一種堿性多肽,可以刺激膠原蛋白表達和細胞增殖,從而促進損傷修復[36]。本研究顯示,3個劑量組的SCH均可上調(diào)創(chuàng)面處VEGF、bFGF和EGF的表達,促進肉芽組織的成熟和再上皮化,從而促進創(chuàng)面愈合。同時對比3個劑量組促生長因子分泌的情況可知,SCH中劑量組可以獲得與高劑量組相似的效果。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究制備的SCH具有促SD大鼠創(chuàng)面愈合的功效。此外,無論在調(diào)節(jié)炎癥反應還是促膠原合成的作用上,SCH中劑量組均表現(xiàn)出最適性,同時在刺激生長因子分泌的效果上,SCH中劑量組已經(jīng)達到與高劑量組相同的作用,故在促創(chuàng)面愈合功效上,SCH中劑量組(0.50 g/kg)表現(xiàn)最優(yōu),這為今后企業(yè)的功能食品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。對于SCH促創(chuàng)面愈合機制的探索發(fā)現(xiàn),SCH通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面處生長因子的分泌量來促進傷口愈合,這可能與生長因子VEGF、bFGF和EGF的表達水平上調(diào)有關(guān),因此可以為進一步研究SCH促創(chuàng)面愈合的機制提供思路和依據(jù)。