纖維蛋白膠復(fù)合博萊霉素對兔下肢淺靜脈的損傷效應(yīng)及纖維化研究

沈艷玲 劉源 楊霞 閆志偉 楊濤 張春誼 宋昌龍 馮瑤 楊耀武

靜脈畸形(venous malformations，VMs) 是來源于血管系統(tǒng)的發(fā)育畸形，過去稱為海綿狀血管瘤。病變由擴張的靜脈管腔或血竇組成。VMs好發(fā)于頭頸部，可造成顏面畸形及言語、吞咽、呼吸等功能障礙。平陽霉素(pingyangmycin，PYM)、博萊霉素(bleomycin,BLM)硬化治療是VMs重要的治療方法[1-3]。PYM是我國自主生產(chǎn)的抗腫瘤抗生素，其成分與國外生產(chǎn)的BLM相近，區(qū)別是PYM以博萊霉素A5成分為主。在大范圍、高回流VMs治療方面，單純PYM或BLM注射后使用效率低，治療周期長，療效欠佳。2005年，楊耀武治療團隊提出了纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G) 復(fù)合PYM栓塞硬化治療VMs的方案，在PYM一度停產(chǎn)期間，應(yīng)用BLM替代PYM進行治療。該方案在治療口腔及面頸部VMs方面療效理想，優(yōu)勢明顯[4-5]。為了揭示其治療機制，本研究通過觀察FG/BLM 注射后家兔下肢淺靜脈的大體及組織病理學(xué)變化，探索該技術(shù)導(dǎo)致靜脈纖維化的過程以及閉鎖VMs的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇健康成年家兔12 只，體重3.5～4.5 kg，雙側(cè)共24 根下肢淺靜脈作為實驗對象。分為FG注射組和FG/PYM注射組，每組注射12 根靜脈。用電動剃毛刀由下向上術(shù)區(qū)剃毛，顯露下肢淺靜脈后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 注射藥物配制 FG配制方法：外用凍干人纖維蛋白粘合劑(護固萊士，上海萊士血液制品股份有限公司)，其中兩組分凍干人纖維蛋白原、凍干人凝血酶分別用滅菌注射用水、氯化鈣溶液中各2 mL溶解，然后抽入雙聯(lián)注射器備用。FG/PYM配制方法：FG配制方法同上。注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社)15 mg+2%利多卡因1 mL+地塞米松1 mL溶解，然后將BLM溶液分別加入FG兩組分各1 mL?；靹蚝蟪槿腚p聯(lián)注射器備用。

1.2.2 注射方法 FG組：用止血帶捆扎兔下肢淺靜脈近心端(圖1)，皮膚消毒后應(yīng)用5 mL注射器從下肢淺靜脈遠(yuǎn)心端穿刺，抽到回血后用雙聯(lián)注射器注射FG 1.5 mL。注射后止血帶捆扎保持3 min。FG/BLM組：選擇家兔另外一側(cè)下肢淺靜脈，抽到回血后用雙聯(lián)注射器注射FG/BLM復(fù)合物1.5 mL。穿刺及靜脈捆扎方法同F(xiàn)G注射組。

圖1 兔下肢淺靜脈(近心端捆扎后)

1.3 取材及標(biāo)本處理

注射后3、7、14、28 d各取3 只動物，鹽酸賽拉嗪注射液(陸眠寧，吉林華牧動物保健品有限公司)肌肉注射麻醉后解剖、顯露經(jīng)注射處理的下肢淺靜脈，大體觀察血管外觀及形態(tài)。切取標(biāo)本，4%多聚甲醛液固定，系列脫水，石蠟包埋，切片，HE及Masson三色法染色。光鏡(奧林巴斯)觀察靜脈壁結(jié)構(gòu)及管腔，纖維組織形成情況等。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

注射后3 d： FG、FG/BLM組大部分血管切斷后無血流，內(nèi)見半透明或暗紅色栓子。部分血管直徑正常，部分血管收縮變細(xì)。FG組膠栓成形較FG/BLM組更為明顯，F(xiàn)G/BLM組部分血管變細(xì)，管壁變薄，血管呈暗紅色。注射后7 d：從外觀看FG、FG/PYM組血管均變細(xì)、充盈不明顯，血管切斷后無血流。FG組仍可見透明或暗紅色栓子，部分成形，提示FG仍未降解，部分成形不明顯。FG/BLM組管腔內(nèi)也可見暗紅色血栓，難以從管腔內(nèi)擠壓出來，提示有纖維化栓子形成可能。注射后14 d：FG、FG/BLM組血管外形、輪廓可見，觸摸呈條索狀，從表面看血管顏色為淺粉紅色，管腔內(nèi)以實性為主，無血流。大部分靜脈內(nèi)未見明顯的FG膠栓，提示FG降解、血管逐漸纖維化。注射后28 d： FG組血管顯著變細(xì)或閉鎖。FG/BLM組血管顏色與周圍接近，幾乎消失(圖2)。

2.2 組織學(xué)觀察

注射后3 d，F(xiàn)G、FG/BLM組血管內(nèi)均以不定形物為主，有纖維細(xì)胞增生，不成熟纖維組織增生現(xiàn)象(圖3)。FG組血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可見，連續(xù)性缺失。FG/PYM組血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)大部消失。注射后1 周，F(xiàn)G、FG/BLM組血管腔內(nèi)可見裂隙，F(xiàn)G組血管壁被增厚的纖維組織取代，管腔內(nèi)纖維組織形成少于FG/BLM組。FG/BLM組血管壁被顯著增厚的纖維組織取代，血管腔內(nèi)有大量成熟或不成熟的纖維組織形成。注射后2 周，F(xiàn)G、FG/BLM兩組管腔均顯著纖維化。FG組管腔可見少量裂隙，F(xiàn)G/BLM大部分血管壁被增生的纖維組織取代。注射后4 周，F(xiàn)G組血管血管腔基本被被纖維組織取代，血管壁依稀可見，F(xiàn)G/BLM組血管腔、血管壁基本消失，被纖維組織取代(圖3)。

3 討 論

BLM類藥物常被用于抗腫瘤治療[6-8]，同時也被廣泛應(yīng)用于血管瘤和脈管畸形的治療。BLM、PYM導(dǎo)致實驗動物靜脈以及人類靜脈畸形纖維化的作用已經(jīng)被大量基礎(chǔ)及臨床研究證實。高慶紅等[9]通過觀察家兔耳后靜脈PYM注射后的組織學(xué)變化，認(rèn)為PYM硬化治療的可能機制為：血管內(nèi)皮細(xì)胞及管壁組織產(chǎn)生非特異性損傷，使細(xì)胞的代謝發(fā)生紊亂，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及管壁組織同時增生，管壁增厚，管腔縮窄及閉鎖。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，兔耳緣靜脈PYM注射后，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹并空泡化，血管內(nèi)膜連續(xù)性中斷，管壁增厚、管腔狹窄、閉鎖。

圖2 兔下肢淺靜脈FG、FG/BLM注射后大體觀察

圖3 兔下肢淺靜脈注射后組織學(xué)觀察(HE染色，×100)

本研究發(fā)現(xiàn)，兔下肢淺靜脈FG、FG/BLM注射后對靜脈血管有明確的栓塞作用，同時與FG復(fù)合的PYM得以長期存留。在一項有關(guān)該技術(shù)的影像學(xué)研究中，也證實了FG/BLM 注射到VMs 瘤腔后對回流靜脈有栓塞、阻斷作用，對注射到瘤腔的硬化劑有貯存作用[11]。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G/BLM復(fù)合注射后能夠早期破壞內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)膜并誘導(dǎo)纖維組織增生。隨著FG的降解，管腔內(nèi)逐漸被纖維組織取代。后期血管壁結(jié)構(gòu)消失，被成熟纖維組織取代。

研究的一個重要發(fā)現(xiàn)是盡管單純FG注射破壞血管、促纖維組織作用弱于于FG/BLM復(fù)合注射，但是仍可導(dǎo)致家兔下肢淺靜脈纖維化。文獻中鮮有單純應(yīng)用FG治療或輔助治療靜脈畸形的報道，Jemec等[12]報道了1 例應(yīng)用單純FG注射治療面頰部VMs的個案，病變消退且未見復(fù)發(fā)。其它報道則以FG輔助手術(shù)減少出血為主。FG的主要成分由凍干人纖維蛋白原、人凝血酶組成，常作為止血劑或粘合劑使用，并非用于治療血管畸形的硬化劑。結(jié)合Jemec等[12]的分析，本研究認(rèn)為FG致家兔下肢淺靜脈和人VMs病變纖維化的可能機制是：(1)FG注射后占據(jù)血管內(nèi)原有血液的空間，導(dǎo)致血管栓塞，膠塊內(nèi)或外周存留部分血凝塊，膠塊及血凝塊與血管內(nèi)皮直接接觸發(fā)揮類似于“血栓”的作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞破壞、血管內(nèi)膜斷裂及成纖維細(xì)胞增生；(2)FG的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)有利于成纖維細(xì)胞增殖以及纖維組織增生，隨著FG的降解，成纖維細(xì)胞逐漸取代FG并大量分泌膠原，形成纖維組織；(3)管腔內(nèi)的血凝塊可以機化并逐漸形成纖維組織。

另一個發(fā)現(xiàn)是FG/BLM復(fù)合注射后對家兔下肢淺靜脈的早期、快速破壞作用。家兔下肢淺靜脈孔徑略大于耳緣靜脈，靜脈壁略厚，為了更有利于觀察FG的栓塞功能，本研究選擇下肢淺靜脈作為觀察對象。雖然選擇的靜脈不同，與以往的實驗研究結(jié)果[9-10]對比，F(xiàn)G、BLM復(fù)合注射后能夠在更早期損傷靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、破壞血管內(nèi)膜。其可能的機制是：FG/BLM注射后BLM能夠較長時間貯存于血管腔局部，逐漸釋放并不斷損傷血管內(nèi)皮。盡管實驗中對家兔靜脈給予了血流阻斷措施，但是阻斷解除后管腔內(nèi)的血液仍有流動性，因此單純BLM注射后藥物會有不同程度的流失，理論上講，其作用于血管內(nèi)皮的有效性會低于FG/BLM復(fù)合注射。

本研究通過觀察FG/BLM對家兔下肢淺靜脈的作用過程，從組織學(xué)的角度揭示了其破壞靜脈并導(dǎo)致其纖維化的機制。由于家兔下肢淺靜脈與人類VMs在解剖形態(tài)、血流動力學(xué)等方面有一定的差異，在后續(xù)研究中，課題組將進一步設(shè)計、構(gòu)建與人類VMs更為接近的動物模型并展開相關(guān)研究。