響應面優(yōu)化超聲輔助提取黃瓜皮多酚工藝及其抗氧化活性研究

陳建福 ，陳健旋 ，袁思琦 ，陳仲巍

（1.漳州職業(yè)技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000；2.天然化妝品福建省高校工程研究中心,廈門醫(yī)學院，福建 廈門 361023）

黃瓜（Cucumis sativus L.），又名青瓜、胡瓜，為葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生或攀緣草本植物，黃瓜營養(yǎng)豐富，種植歷史悠久，在我國各個地方均有分布[1-2]。黃瓜主要由黃瓜籽、黃瓜肉和黃瓜皮三部分組成，其中黃瓜皮是最容易被人們忽視的部分，其含有多糖、多酚、綠原酸、氨基酸等多種天然有效營養(yǎng)活性成分，具有生津止渴、排毒、清腸、降尿酸、護腎、養(yǎng)顏等多種功效[3-4]。其中多酚是植物的次生代謝產物，廣泛存在于植物果、皮、葉、莖和根中，具有抗血栓、抗炎、抑菌、抗氧化、抗凝血和抗衰老等多種生物生理活性，廣泛應用于化妝品、飼料、食品等各個領域中[5-6]。本文以黃瓜皮為原料，對影響黃瓜皮多酚提取率的工藝因素進行Box-Behnken 設計與響應面優(yōu)化，并研究了黃瓜皮多酚的抗氧化活性，為黃瓜皮多酚的提取與綜合開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃瓜，亮美1 號，購于漳州市新華都超市，使用時將黃瓜用清水洗凈，再將黃瓜皮削下，風干，后放于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后篩選備用。乙醇，食品級，河南鑫河陽酒精有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

KQ-100TDE 型高頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1100 型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的測定

采用福林-酚法[7]，配制100 mg/L 沒食子酸標準溶液，分別移取一定體積的沒食子酸標準溶液到容量為10 mL 的容量瓶中，再分別加入0.5 mL 福林-酚試劑，搖勻后靜置1 min，然后加入1.5 mL 質量分數為20%的Na2CO3溶液，定容。于75 ℃反應10 min 后置于765 nm 分光光度計下測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，沒食子酸濃度（mg/L）為橫坐標，得標準曲線為 y=0.084x+0.006，R2=0.999 0。

1.2.2 黃瓜皮多酚含量的測定

取一定量的黃瓜皮提取液，根據上述標準曲線測定方法，將分光光度計波長設為765 nm，測定溶液的吸光值。根據標準曲線能夠計算出多酚的濃度，因而得到多酚物質的提取率：

式中：V 為提取液體積（L）；m 為黃瓜皮質量（g）；b 為黃瓜皮多酚質量濃度（mg/L）。

1.2.3 黃瓜皮多酚的提取工藝

準確稱取3 份1 g 的黃瓜皮制成的粉末，分別把粉末裝入100 mL 燒瓶中，按所考察的工藝條件加入設定的乙醇，后置于高頻數控超聲波清洗器中進行提取，結束后過濾、定容，按“1.2.2”方法計算黃瓜皮多酚的提取率，結果取平均值。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 超聲溫度的篩選

準確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入25 mL 60%的乙醇，分別在 55、60、65、70、75 和 80 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過濾、定容，研究不同超聲溫度對黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的超聲溫度。

1.2.4.2 乙醇濃度的篩選

準確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%和 90%（體積分數）的25 mL 乙醇溶液，在65 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過濾，定容，研究不同乙醇濃度對黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的乙醇濃度。

1.2.4.3 液料比的篩選

準確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，分別加入10、15、20、25、30 和 35 mL 的 60%乙醇，在 65 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過濾，定容，研究不同液料比對黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的液料比。

1.2.4.4 超聲時間的篩選

準確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入25 mL 的60%乙醇，在65 ℃超聲波清洗器內分別超聲10、20、30、40、50、60 min，過濾，定容，研究不同超聲時間對黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的超聲時間。

1.2.5 響應面試驗設計

在黃瓜皮多酚提取單因素試驗的基礎上，將多酚提取率作為響應值，選取超聲溫度、乙醇濃度、液料比、超聲時間作為試驗的4 個因素，如表1 所示，并結合Box-Behnken 設計原理，設計出四因素三水平試驗，對提取黃瓜皮多酚的工藝進行響應面優(yōu)化。

表1 Box-Behnken 響應面因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response methodology

1.2.6 黃瓜皮多酚的抗氧化活性測定

1.2.6.1 ·OH 清除率的測定

取2 mL 不同質量濃度的黃瓜皮多酚溶液，并分別加入2 mL 濃度為9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 濃度為9 mmol/L 的FeSO4溶液，混合均勻后再加入0.01% H2O2溶液1 mL 反應60 min，反應結束后，用蒸餾水定容，測定溶液在510 nm 處吸光度Ai；并分別以蒸餾水代替H2O2溶液為對照組，測得吸光度Aj，以蒸餾水代替黃瓜皮多酚為空白組，測得吸光度A0，按下式計算出黃瓜皮多酚對·OH 的清除率。

·OH 清除率（%）=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.2.6.2 DPPH·清除率的測定

取2 mL 不同質量濃度的黃瓜皮多酚溶液，并分別加入2 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，混合均勻后，反應30 min，反應結束后測試其在517 nm 處的吸光度Ai；取2 mL 不同質量濃度的黃瓜皮多酚溶液，加入2 mL 乙醇，測定其在517 nm 處的吸光度Aj；取2 mL 蒸餾水加入2 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH溶液，測得吸光度A0；并以VC 作對照，按下式計算得黃瓜皮多酚對DPPH·的清除率。

DPPH·清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.7 數據處理

采用Microsoft Excel 2007 進行存儲與數據分析，用Origin 8.0 進行繪圖，用Design-Expert 8.05b 軟件進行響應面回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲溫度對多酚提取率的影響

如圖1 所示，當超聲溫度為65 ℃時，黃瓜皮多酚提取率達到最大值，超聲溫度超過65 ℃后，多酚提取率沒有繼續(xù)增加，而是開始降低。這是因為超聲溫度的升高，會促進多酚分子的熱運動而加快多酚物質溶出的速度；但超聲溫度過高時，部分多酚的物質結構會被破壞，從而降低提取率[8]。由此，適宜的超聲溫度為 65 ℃。

圖1 超聲溫度對多酚提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic temperatures on the extraction yields of polyphenols

2.1.2 乙醇濃度對多酚提取率的影響

圖2 乙醇濃度多酚對提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

如圖2 所示，當乙醇濃度為60%時，黃瓜皮多酚提取率達到最大值，乙醇濃度超過60%后，多酚提取率沒有繼續(xù)增加，而是開始降低。這是因為乙醇濃度的增大，會加快多酚和多糖、蛋白質等物質之間的疏水作用力及氫鍵的斷裂，使多酚提取率上升；但乙醇濃度過大時，黃瓜皮顆粒中醇溶性物質會加快溶出，從而阻礙多酚物質的溶出[9]。由此，適宜的乙醇濃度為60%。

2.1.3 液料比對多酚提取率的影響

如圖 3 所示，當液料比為 25∶1（mL/g）時，黃瓜皮多酚提取率達到最大值，液料比超過25∶1（mL/g）后，多酚提取率沒有繼續(xù)增加，而是開始降低。這是因為隨著液料比的增加，溶劑和原料之間的接觸面積也會增加，使多酚更多地溶解出來；但液料比過大時，溶劑和原料已經充分結合，多余的溶劑會使過多雜質溶出，而導致提取率下降，同時，考慮到降低能耗、減少溶劑用量、降低原料等各方面的因素[10]，選擇適宜的液料比為 25∶1（mL/g）。

圖3 液料比對多酚提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

2.1.4 超聲時間對多酚提取率的影響

如圖4 所示，當超聲時間為30 min 時，黃瓜皮多酚提取率達到最大值，超聲時間超過30 min 后，多酚提取率沒有繼續(xù)增加，而是開始降低，這是因為在一定超聲時間范圍內，多酚逐漸溶出，多酚提取率增大，但超聲時間過長時，超聲波的熱效應導致多酚中相關不穩(wěn)定組分的降解，使得提取率降低[11]，由此，適宜的超聲時間為30 min。

圖4 超聲時間對多酚提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.2 響應面工藝優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

以黃瓜皮多酚提取率為響應值，應用Box-Behnken試驗設計原理，選擇超聲溫度（A）、乙醇濃度（B）、液料比（C）和超聲時間（D）為影響因素，得出試驗結果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.05b 軟件對表2 的試驗數據進行響應面回歸分析，可得多酚提取率為響應值的二次多項回歸模型為：

Y=10.28+0.052A+0.19B+0.17C+0.21D-0.015AB+0.053AC-0.097AD-0.12BC-0.12BD-0.10CD-0.35A2-0.37B2-0.36C2-1.04D2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

對回歸模型進行方差分析，以此檢驗各因素對多酚提取率的影響，結果見表3。由表3 可得，回歸模型的F=25.04，P＜0.000 1，表明模型極顯著。失擬項P=0.934 2＞0.05，表示差異不顯著，具有較好的擬合性，由隨機的誤差引起小偏差；該方程模型的決定系數R2=0.961 6，證明有96%以上的試驗值可以利用該模型來分析與預測。綜上分析可知該回歸模型的擬合度高，響應面值和各因素之間關系都能夠被較好地描述出來，因此可用該回歸模型來代替試驗對黃瓜皮多酚的提取率進行預測與分析。各因素對響應值的影響不同，不是簡單的線性關系，其中一次項B、C、D 及二次項 A2、B2、C2和 D2對響應值影響極顯著（P＜0.01），其余項均影響不顯著。

2.2.2 響應曲面圖分析

為進一步分析超聲溫度、乙醇濃度、液料比和超聲時間對黃瓜皮多酚提取率的影響，通過Design-Expert 8.05 b 軟件繪制出響應面和等高線圖，如圖5～10 所示。圖中顯示固定所考察因素中的任意兩個因素時，另兩個因素交互作用的影響。從響應面中的曲面坡度和等高線中線的疏密程度可以反映出所考察工藝之間交互作用的強弱，即響應面曲面的坡度越陡，傾斜度越高，等高線形狀越趨向橢圓，等高線密度越大，表示該交互作用越顯著[12]。對圖5～10 進行分析可知，響應面曲面傾斜度最大，等高線密度最大的是乙醇濃度和超聲時間的交互作用圖，說明乙醇濃度和超聲時間的交互作用對響應值的影響最顯著；同理分析，可以得到四個因素之間交互作用對響應值的影響顯著程度順序為：BD＞BC＞CD＞AD＞AC＞AB。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

利用軟件對所建立的模型進行分析，得到黃瓜皮多酚的最佳提取工藝為：超聲溫度65.36 ℃，乙醇濃度 62.10%，液料比 25.96∶1（mL/g），超聲時間 30.76 min，此條件下多酚提取率預測值為10.33 mg/g?？紤]操作的方便性，選取超聲溫度65 ℃，乙醇濃度62%，液料比 26∶1（mL/g）、超聲時間 31 min 進行驗證試驗。在此修改后的最佳工藝條件下進行3 次平行試驗，所測多酚提取率的平均值為（10.29±0.14）mg/g，與預測值相對誤差為0.39%，證明了回歸模型的有效性，由此可以說明應用響應面法所得到的提取工藝的參數可行性強、可靠性高。

圖5 超聲溫度與乙醇濃度的交互作用對多酚提取率的影響Fig.5 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

圖6 超聲溫度與液料比的交互作用對多酚提取率的影響Fig.6 Interaction effects of ultrasonic temperatures and liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

圖7 超聲溫度與超聲時間的交互作用對多酚提取率的影響Fig.7 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

圖9 乙醇濃度與超聲時間的交互作用對多酚提取率的影響Fig.9 Interaction effects of ethanol concentrations and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

圖10 液料比與超聲時間的交互作用對多酚提取率的影響Fig.10 Interaction effects of liquid-to-material ratios and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.4 黃瓜皮多酚的抗氧化活性

2.4.1 黃瓜皮多酚對·OH 的清除作用

如圖11 所示，利用黃瓜皮多酚對·OH 清除作用來評價其抗氧化能力。從圖中可知，隨著黃瓜皮多酚和VC 質量濃度的升高，其對·OH 的清除率均不斷增大，當黃瓜皮多酚質量濃度為350 mg/L 時，對·OH 清除率達到85.74%，說明黃瓜皮多酚具有較強的·OH清除能力，黃瓜皮多酚和VC 對·OH 清除率的IC50分別為116.60 mg/L 和97.59 mg/L，說明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性。

圖11 黃瓜皮多酚和VC 對·OH 的清除作用Fig.11 Scavenging effects on·OH of polyphenols and VC

2.4.2 黃瓜皮多酚對DPPH·的清除作用

圖12 黃瓜皮多酚和VC 對DPPH·的清除作用Fig.12 Scavenging effects on DPPH·of polyphenols and VC

如圖12 所示，利用黃瓜皮多酚對DPPH·清除作用來評價其抗氧化能力。從圖中可知，隨著黃瓜皮多酚和VC 質量濃度的升高，對DPPH·的清除率均不斷增大，當黃瓜皮多酚質量濃度為140 mg/L 時，對DPPH·清除率達到82.15%，說明黃瓜皮多酚具有較強的DPPH·清除能力，黃瓜皮多酚和VC 對DPPH·清除率的IC50分別為57.41 mg/L 和47.68 mg/L，說明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性,且抗氧化活性與多酚濃度呈正相關。

3 結論

本研究采用超聲波輔助法提取黃瓜皮多酚，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法分析，建立了多酚提取率和考察工藝之間的回歸模型，優(yōu)化得出提取多酚的最佳工藝條件為：超聲溫度65 ℃，乙醇濃度62%，液料比 26∶1（mL/g），超聲時間 31 min，在此條件下得到的多酚提取率為（10.29±0.14）mg/g，與預測值（10.33 mg/g）相對誤差為0.39%，證明了回歸模型的有效性，說明應用響應面法所得到的提取工藝參數可行性強、可靠性高。黃瓜皮多酚對·OH 和DPPH·清除率的IC50值分別為116.60 mg/L 和57.41mg/L，表明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性，且抗氧化活性與多酚濃度呈正相關，該研究為將黃瓜皮多酚開發(fā)成天然抗氧劑提供理論基礎。