雷公藤甲素對人腎癌A498細胞增殖、遷移及侵襲的影響

曹 波 付 剛 王曉敏 柴春香 張兆光 陳學(xué)勛

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院泌尿外科，山東青州 262500；3.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院病理科，山東青州 262500；4.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，山東濰坊 261041；5.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東濰坊 261041

腎細胞癌（RCC）是成年人腎臟惡性腫瘤的最常見類型，起源于近曲小管，所占比例約90%[1-2]。手術(shù)治療是首選治療方法，RCC的5年存活率可達到65%～90%[1]。當癌細胞轉(zhuǎn)移，或者因其他疾病失去手術(shù)機會時，存活率大大降低，因此積極探索晚期RCC 有效治療藥物成為研究熱點。PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活在腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲中起到重要的作用[3-8]。雷公藤甲素是雷公藤植物的有效成分提取物，可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡、干擾腫瘤細胞周期、抑制腫瘤血管生成，從而達到抗腫瘤的效果[9-10]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可通過PI3K/AKT/MTOR信號通路抑制卵巢癌細胞和胃癌細胞的增殖及侵襲[11-13]，而在腎細胞癌中的作用鮮有報道。本研究探討雷公藤甲素通過PI3K/AKT/MTOR信號通路對腎癌A498細胞增殖、遷移和侵襲的影響，旨在為進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腎癌A498細胞（ATCC 細胞庫）；雷公藤甲素（美國sigma 公司）；β-actin、AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)公司）；MTT 試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)公司）；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、5×SDS 蛋白上樣緩沖液、二甲基亞砜及牛血清白蛋白（廣州碧云天生物技術(shù)研究所）；ECL 試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞系和培養(yǎng)環(huán)境 A498細胞在含10%FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雷公藤甲素配置：將1 mg 雷公藤甲素加入3.47 mL的二甲基亞砜中溶解，再加入0.9%的無菌生理鹽水稀釋成相應(yīng)終濃度的雷公藤甲素，過濾膜過濾后再分裝至EP 管，放在-20℃冰箱中備用。

1.2.2 實驗分組 經(jīng)雷公藤甲素濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50 μmol/L）篩選實驗后，確定IC50，根據(jù)IC50確定雷公藤甲素相對最佳劑量，共分為3組：對照組為雷公藤甲素0 nmol/L、低劑量組為雷公藤甲素200 nmol/L、高劑量組為雷公藤甲素400 nmol/L。

1.2.3 Western Blot 細胞在RIPA 裂解液中4℃下裂解20 min，之后細胞裂解液10 000 g 下離心10 min清除雜物，蛋白濃度通過BCA 進行測定。裝載樣品并在10%SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離，之后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，膜在5%牛血清白蛋白（BSA）室溫下封閉1 h，與原抗體分別在4℃過夜。TBS-tween 三次洗滌后，進一步在室溫下與羊抗兔或羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗反應(yīng)1 h。蛋白檢測采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒，條帶密度通過Quantity One 軟件進行測定。

1.2.4 細胞侵襲實驗 24 孔細胞培養(yǎng)板與多孔聚乙烯對苯二甲酸酯膜（8 μm 孔徑）分別用于檢測細胞侵襲能力。上層培養(yǎng)板為覆膜膠，然后接種5×105活細胞在DMEM 培養(yǎng)基。下層培養(yǎng)基中添加20%FBS 作為趨化因子。37℃下培養(yǎng)16 h后，細胞侵襲至膜的下面，用PBS 沖洗，甲醇固定和水晶藍染色。在7個隨機域的光鏡下計數(shù)細胞數(shù)。

1.2.5 細胞遷移實驗 通過24 孔板細胞培養(yǎng)對細胞的遷移能力進行分析。上室接種5×105活細胞，下室充滿了含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中作為趨化因子。37℃下培養(yǎng)16 h后，穿過膜的細胞用PBS 沖洗，甲醇固定和水晶藍染色。在7個隨機域的光鏡下計數(shù)細胞數(shù)。

1.2.6 細胞增殖實驗 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，密度為0.3×103個/孔。細胞培養(yǎng)8 h后，每24小時加入不同濃度的雷公藤甲素。在48 h 加入MTT。細胞在37℃下培養(yǎng)4 h后完全去除培養(yǎng)基。然后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液。在黑暗下?lián)u晃15 min，然后用酶標儀測定在490 nm 處細胞的光密度（optical density，OD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達情況的比較

高劑量組、低劑量組的p-AKT、p-MTOR表達均低于對照組，高劑量組的p-AKT、p-MTOR表達低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組的AKT和MTOR蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1、表1）。

圖1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白的表達情況

表1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達情況的比較（）

表1 三組AKT、p-AKT、MTOR 和p-MTOR蛋白表達情況的比較（）

與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

組別 AKT p-AKT MTOR p-MTOR對照組低劑量組高劑量組1.56±0.15 1.39±0.14 1.32±0.16 0.96±0.09 0.56±0.07a 0.35±0.06ab 1.13±0.09 1.06±0.07 0.99±0.07 0.91±0.08 0.53±0.05a 0.32±0.03ab

2.2 三組不同時間點OD值的比較

高劑量組、低劑量組24、48、72 h的OD值低于對照組，高劑量組24、48、72 h的OD值低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、低劑量組、高劑量組48、72 h的OD值均高于24 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組不同時間點OD值的比較（）

表2 三組不同時間點OD值的比較（）

與對照組同期比較，aP＜0.05；與低劑量組同期比較，bP＜0.05；與本組24 h 比較，cP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組低劑量組高劑量組0.56±0.10 0.25±0.06a 0.11±0.04ab 0.78±0.15c 0.42±0.07ac 0.22±0.04abc 0.93±0.16c 0.61±0.08ac 0.42±0.07abc

2.3 三組細胞遷移、侵襲能力的比較

高劑量組、低劑量組的細胞遷移、侵襲能力均低于對照組，高劑量組的細胞遷移、侵襲能力低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 三組細胞遷移、侵襲能力的比較（個/視野，）

表3 三組細胞遷移、侵襲能力的比較（個/視野，）

與對照組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05

組別 細胞遷移 穿膜細胞數(shù)對照組低劑量組高劑量組23.50±5.38 11.60±3.24a 6.43±1.05ab 94.32±4.12 58.18±3.36a 25.54±3.47ab

3 討論

RCC是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病較隱匿，且侵襲性較強，多數(shù)發(fā)展到晚期才被發(fā)現(xiàn)[1-2]。因?qū)Ψ暖熀突煹缺Ｊ匦灾委煵幻舾?，外科手術(shù)仍是最佳的治療方法，雖然聯(lián)合新輔助性化療方案取得較好的療效，但是患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍較高[1-2，14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，靶向藥物具有精準治療及全身副作用少的優(yōu)勢，成為晚期腎細胞癌的主要治療手段之一，為晚期患者提供更有效的治方案，從而提高患者的生存期和生存質(zhì)量[3，15-16]。

PI3K/AKT/MTOR信號通路在細胞中廣泛存在，并參與細胞的增殖、凋亡及血管生成等[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，針對此信號通路的分子靶向治療成為目前研究的熱點[15-18]，通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活，可以降低肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌等多種癌細胞的生長、遷移和侵襲能力[19-24]。有研究運用PI3K/MTOR 雙重阻斷劑NVP-BEZ235 體外處理腎癌A498細胞系，明顯抑制腎癌A498細胞系中磷酸化蛋白p-AKT 和p-MTOR的表達，從而抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲[4]。前期研究表明，激活PI3K/AKT/MTOR信號通路，可促進腎癌細胞的遷移和侵襲。以上研究充分說明PI3K/AKT/MTOR信號通路在腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起到重要的作用[8]。

雷公藤甲素是傳統(tǒng)中藥雷公藤的提取物，自發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素有抗腫瘤作用后，諸多研究通過多途徑多通路誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡、干擾腫瘤細胞周期、抑制腫瘤血管生成，從而達到抗腫瘤的效果[9]。閻瑋蘭[11]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素通過抑制MV411 細胞PI3KAKT-mTOR 通路蛋白的表達，從而抑制MV411 細胞的增殖。王昊等[12]同樣發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對TM4 細胞氧化應(yīng)激及PI3K/AKT 通路有明顯抑制作用。白俊等[13]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素通過PI3K/AKT/mTOR 通路誘導(dǎo)卵巢顆粒細胞自噬。以上研究均評價了雷公藤甲素通過影響PI3K/AKT/MTOR信號通路對腫瘤細胞起到抑制作用，而在腎細胞癌中報道少見[11-13]。本研究通過檢測AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR表達情況來評價雷公藤甲素對其影響，從而明確雷公藤甲素是否通過該通路起到抗腫瘤的作用，結(jié)果顯示，高劑量組、低劑量組的p-AKT、p-MTOR表達均低于對照組，高劑量組的p-AKT、p-MTOR表達低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示雷公藤甲素可以抑制腎癌A498細胞系中PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活。細胞增殖、遷移和侵襲是腎癌發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)特性[1-3，8]，也是腫瘤治療的難點。本研究結(jié)果顯示，高劑量組、低劑量組24、48、72 h的OD值低于對照組，高劑量組24、48、72 h的OD值低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與預(yù)后關(guān)系密切，是影響抗腫瘤治療效果的關(guān)鍵因素之一[1-2，8]。通過對細胞遷移、侵襲的實驗室評價，結(jié)果顯示高劑量組、低劑量組的細胞遷移、侵襲能力均低于對照組，高劑量組的細胞遷移、侵襲能力低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示雷公藤甲素通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活，從而抑制腎癌A498細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與以往報道一致[10-13]。

綜上所述，雷公藤甲素可通過抑制PI3K/AKT/MTOR信號通路，從而抑制腎癌A498細胞的增殖、遷移和侵襲，為今后腎癌細胞藥物治療及具體機制研究提供理論思路。