GJB2突變相關(guān)的遲發(fā)性遺傳性聾研究進展

秦夢瑤 馮永 吳學文

中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉重大疾病湖南省重點實驗室（長沙 410008）

GJB2基因定位于13q11-12，全長為4804bp，編碼區(qū)為678bp，由兩個外顯子組成，其啟動子區(qū)域共有7個GC盒[1,2]，表達來源于外胚層的組織中，編碼產(chǎn)物是縫隙連接蛋白26（Connexin26，Cx26），是耳蝸間隙連接的主要組成部分[3]。臨床上，GJB2（Cx26）突變可以導致DFNB 1(隱性)和DFNA 3(顯性)非綜合征型耳聾，是非綜合征耳聾的最常見的病因之一[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變不僅引起先天性聽力損失，部分患者出生時聽力正常，可出現(xiàn)遲發(fā)性聾[5-7]。但其導致遲發(fā)性聾的潛在致病機制至今尚未完全明確，本文旨在將近年來GJB2突變相關(guān)的遲發(fā)性聾的研究進展進行綜述,以期進一步探索GJB2的致聾機制與治療措施。

1 GJB2基因突變與遲發(fā)性聾

隨著遺傳性耳聾的研究不斷開展，越來越多的基因突變種類被發(fā)現(xiàn)。截止到目前，已發(fā)現(xiàn)共有432種GJB2基因突變，其中386種突變與耳聾相關(guān)（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GJB2）。其突變具有一定的種族與地區(qū)差異性。c.35 delG突變多發(fā)現(xiàn)于歐洲和中東[8,9]；c.235 delC突變常出現(xiàn)在東亞[10]；p.V37I突變常見于亞洲，尤其是東南亞[11,12]；W24X突變主要分布在印度[4],其他突變?nèi)鏲.167 delT和p.R143W分別可見于猶太人和加納人中[13,14]。由于GJB2基因突變位點具有多樣性，并存在一定的非外顯率，且基因型與聽力受損外顯時間存在一定的關(guān)系，GJB2的突變可表現(xiàn)為出生后遲發(fā)性、漸進性耳聾[6,12,15]。Chai Y團隊[16]研究發(fā)現(xiàn)在GJB2基因的p.V37I純合突變的聽力損失人群中，先天性聽力損失的發(fā)病率是65%（11/17），遲發(fā)性聽力損失發(fā)病率為35%（6/17），在2012年LI團隊[17]進行了流行病學研究，也證明p.V37I突變無論是復(fù)合雜合還是純合突變，均可能導致進展的、遲發(fā)的聽力損失；Pagarkar W等人[18]曾在隨訪中發(fā)現(xiàn)2例c.35 delG純合子突變的患者，出生時聽力均正常，一例在3歲左右時出現(xiàn)高頻聽力下降,另一例在6個月大時出現(xiàn)聽力受損；Gandía M團隊[19]對一個西班牙家系的研究發(fā)現(xiàn)，c.35 delG雜合突變及少量錯義突變(p.M34T、p.V37I和p.L90P)與遲發(fā)性的輕中度感音神經(jīng)性聾相關(guān)；Kecskeméti N[20]等學者也在大樣本的匈牙利患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)，c.35 delG與p.V37I的雜合突變可導致遲發(fā)性的聽力受損；Petersen MB等[21]學者在一個希臘家系的研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因中雜合子c.35delG突變是出現(xiàn)遲發(fā)性聾的原因；Minami等人[6]對924例聽力受損患者行GJB2突變檢測后，發(fā)現(xiàn)有14例攜帶GJB2基因突變的兒童為遲發(fā)性聽力受損，出生時聽力篩查均通過。以上研究表明，GJB2基因突變與遲發(fā)性聾相關(guān)，且突變種類多樣（如表1）。因此，有GJB2基因突變兒童即使出生時聽力篩查通過，也仍需進一步觀察隨訪。

表1 與遲發(fā)性聾相關(guān)的GJB2基因突變Table 1 GJB2’s Mutation Associated with Late-onset Hearing Loss

2 GJB2基因致遲發(fā)性聾的可能機制

近年來，對GJB2基因突變引起遺傳性聾的致病機制研究取得了一定的進展，但仍未完全闡明。既往的研究發(fā)現(xiàn)小鼠Gjb2基因突變所致聽力損失可能與耳蝸發(fā)育障礙（包括內(nèi)毛細胞的帶狀突觸發(fā)育不良）、毛細胞變性和耳蝸內(nèi)電位（Endocochlear potential,EP）減少[22-26]有關(guān)。這些研究對GJB2突變相關(guān)的先天性聾的致病機制進行了闡述，而未能清晰闡明遲發(fā)性聾的機制。

2.1 Cx26表達缺陷可引起耳蝸主動放大功能障礙并進一步導致遲發(fā)性聾

研究表明聽覺的產(chǎn)生不僅需要有正常發(fā)育的耳蝸結(jié)構(gòu)，還需要外毛細胞(Outer hair cell,OHC)的電活動和纖毛運動共同產(chǎn)生能動的耳蝸力學來擴大聽覺刺激，提高聽力靈敏度和頻率選擇性，OHC電活動是耳蝸主動放大器的基礎(chǔ)，當OHC的電活動受損時可能導致耳蝸的主動放大功能減弱，出現(xiàn)聽力損失[27,28]。2000年Zhao HB團隊[29]發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)耳Deiters細胞（Deiters Cells,DCs）的機械刺激或DCs之間縫隙連接的變化均會減弱外毛細胞的電活動而出現(xiàn)聽力受損，但研究未明確支持細胞的縫隙連接是否也會產(chǎn)生影響；在2013年Zhu Y等[30]靶向敲除Cx26在DCs和柱狀細胞（Outer pillar cells,OPCs）中的表達，發(fā)現(xiàn)Cx26的缺乏限制了基底膜上的OPCs功能，導致OHC的電動力在超極化方向上向左移動，減少耳蝸的主動放大，出現(xiàn)聽覺腦干反應(yīng)（Auditory brainstem response,ABR）與畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（Distortion product otoacoustic emission,DPOAE）閾值的逐漸升高，證明耳蝸主動放大功能依賴支持細胞間隙連接；兩年后該團隊[31]采用時間控制的誘導基因敲除技術(shù)在小鼠出生后第10天敲除耳蝸中Cx26的表達，小鼠出現(xiàn)類似于臨床遲發(fā)性聾的聽力表現(xiàn)。在研究中用雙正弦法測量OHC的電動力相關(guān)非線性電容(Non-linear capacitance,NLC)時發(fā)現(xiàn)其在去極化方向向右移動，電壓依賴的斜率減小，而OHC電動力的右移是可以減少耳蝸主動放大功能的[32]。研究還發(fā)現(xiàn)隨著時間推移，ABR閾值逐漸升高，但EP下降并不明顯，進行免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)耳蝸內(nèi)Cx26幾乎無標記，但小鼠耳蝸發(fā)育正常，耳蝸隧道正常開放，亦無明顯毛細胞脫落。這些數(shù)據(jù)提示Cx26缺乏導致的遲發(fā)性聽力損失可能與耳蝸主動放大功能受損有關(guān)，而不是細胞變性脫落、耳蝸發(fā)育障礙及EP下降的結(jié)果；2017年Zong L等人[33]在證明以上機制的同時，進一步研究發(fā)現(xiàn)聽力損失和耳蝸主動放大的受損程度是逐漸發(fā)展的，隨著年齡的增長，聽力損失從高頻區(qū)擴展到低頻區(qū)，而且在高頻區(qū)和低頻區(qū)的損失程度存在差異。可見，Cx26缺乏可能導致OHC電活動向左或向右位移，降低耳蝸主動放大功能，出現(xiàn)遲發(fā)性聽力受損，且受損程度隨著時間的推移逐漸進展。

2.2 GJB2基因突變可能通過改變氧化應(yīng)激水平加速遲發(fā)性聾的進展

氧化應(yīng)激影響機體許多系統(tǒng)的縫隙連接蛋白表達和縫隙連接通道功能，縫隙連接蛋白功能異常時，氧化應(yīng)激增加可以加重聽力受損[34]。2018年Fetoni AR等[35]學者對遲發(fā)性聾的機制進行了補充，其團隊對攜帶c.35 delG雜合子突變的Gjb2+/-小鼠進行聽力測試，觀察到從2個月齡開始，有基因突變小鼠的ABR和DPOAE閾值逐漸增加，出現(xiàn)遲發(fā)性的聽力損失；他們進一步研究發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)耳的Cx26部分缺乏，導致間隙連接網(wǎng)絡(luò)對上皮細胞的營養(yǎng)傳遞減少，使核因子紅質(zhì)相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)這一耐受氧化還原應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄不能正常進行，出現(xiàn)Nrf2通路的功能障礙，氧化還原平衡失調(diào)，耳蝸的抗氧化功能減弱，氧化應(yīng)激增加，加速耳蝸的老化，出現(xiàn)與年齡相關(guān)的遲發(fā)性聾。同時有流行病學研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變可能與噪聲性聽力損失(Noise-induced hearing loss,NIHL)有關(guān)[36,37]。為了進一步探討Cx26（GJB2）與NIHL的關(guān)系，Zhou等學者[38]在生后第18天(P18)建立了Cx26基因敲除小鼠模型，觀察噪聲暴露前后小鼠的聽閾和形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)噪聲組小鼠的OHC損失是主要的病理改變，其毛細胞與支持細胞大量丟失，Cx26缺乏導致間隙連接功能障礙并阻礙活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的傳播，導致過度堆積，已有研究發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生可能是NIHL的一個潛在原因[39]，于是該團隊分析提出噪聲暴露和Cx26缺失聯(lián)合作用引起ROS過度生成，氧化應(yīng)激增加，出現(xiàn)細胞死亡而導致遲發(fā)性噪音性聽力損失。2019年Lin X團隊[40]的研究也發(fā)現(xiàn)，有p.V37I突變的小鼠在6個月大時出現(xiàn)聽力損失，在其內(nèi)耳僅發(fā)現(xiàn)Cx26半通道形態(tài)發(fā)生微小改變，該通道保持完整，但縫隙連接之間的距離與對照組相比有變短，這些病理改變沒有破壞小鼠耳蝸功能，但使小鼠極易受噪音等環(huán)境因素的影響，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，加速遲發(fā)性聾的進展。

2.3 自噬在GJB2基因突變的遲發(fā)性聾中的作用

自“自噬”這一細胞保護機制被提出以來，許多學者在感音神經(jīng)性聾如藥物性聾、噪聲性聾、年齡相關(guān)性聾等的研究中也發(fā)現(xiàn)，自噬與氧化應(yīng)激機制一道參與促進內(nèi)耳毛細胞的正常功能維持[41,42]。細胞自噬通過降解已經(jīng)氧化的蛋白質(zhì)和活性氧，從而降低、中和氧化應(yīng)激水平，減緩聽力損失，因此是一種自我保護方式。還有小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Cx26部分缺乏加強氧化應(yīng)激，無法減緩毛細胞死亡和聽力喪失，提示自噬可能也參與介導GJB2突變相關(guān)的遲發(fā)性聾[43]。但細胞自噬的分子、信號機制及在GJB2突變相關(guān)遲發(fā)性聾模型中如何精準逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激/自噬水平仍有待進一步探索。

3 GJB2基因致遲發(fā)性聾的聽力變化

GJB2基因突變導致的遲發(fā)性聾聽力受損的表型多樣，呈輕度至極重度不等[44]。日本Minami等人[6]研究發(fā)現(xiàn)14例遲發(fā)性聾患者聽力損失為中度至極重度；Pagarkar W等人[18]報道2例c.35 delG純合突變的遲發(fā)性聾患者均為重度聽力損失；Chai Y等[16]發(fā)現(xiàn)6例攜帶p.V371純合子突變的遲發(fā)性聾患者中，4例為輕或中度聽力損失，2例為重度聽力損失。可見，GJB2基因突變導致的遲發(fā)性聾的聽力損失程度不一，這可能與遲發(fā)性聾初次診斷的時間有關(guān)[45]。

4 GJB2基因相關(guān)的遲發(fā)性聾的動物模型

動物模型是基礎(chǔ)生物學和人類疾病機理研究的基本工具，也是疾病防治研究和治療手段開發(fā)必經(jīng)之路的基石[46]，因此為了進一步探討GJB2基因突變相關(guān)的遲發(fā)性聾的致病機制，建立相關(guān)的動物模型是有必要的（如表2）。目前所用的實驗動物主要以小鼠為主。Lin X團隊[23]為了研究Cx26突變的致聾機制在2009年通過三種不同啟動子建立了不同的小鼠模型（Pax2、Foxg1、Rosa26），其中Rosa26小鼠模型在P19注射4-羥基他莫昔芬去除Cx26基因繼而建立一種時間依賴性條件性基因敲除小鼠模型。2014年該團隊[47]將Cx26loxp/loxp小鼠與Rosa26Cre/Esr1小鼠雜交獲得Cx26條件敲除小鼠，分別在出生后第1、6、12天對小鼠注射他莫昔芬（Tamoxifen,TMX），激活 Cre重組酶，去除Cx26基因，觀察遲發(fā)性聾小鼠的病理改變。2015年Zhu Y團隊[31]對雜交獲得的CKO小鼠在P10注射TMX敲除Cx26的表達研究遲發(fā)性聾的發(fā)病機制。因此，通過控制Cx26loxP/loxP;Rosa26CreER小鼠耳蝸中Cx26基因的敲除時機及程度，可以建立不同時間點不同程度Cx26基因敲除的遲發(fā)性耳聾模型。2018年Fetoni AR等人[35]用Gjb2loxP/loxP小鼠與Tg(Sox10-cre)1Wdr小鼠回交10代獲得C57bl/6n小鼠，再用PCR技術(shù)進行基因分型識別，獲得Gjb2+/-小鼠模型與Gjb2-/-小鼠模型，由于Gjb2-/-小鼠有先天性聽覺障礙，所以使用Gjb2+/-小鼠模型，敲入c.35 delG雜合子突變，建成了c.35 delG雜合子攜帶者的模型，隨著時間的推移，發(fā)現(xiàn)該小鼠的ABR和DPOAE逐漸惡化，出現(xiàn)類似于遲發(fā)性聾的臨床表現(xiàn)。2019年Lin X團隊[40]用胚胎干細胞基因靶向法建立了純合子p.V37I敲入小鼠模型，敲入小鼠表現(xiàn)出與p.V37I突變類似的疾病進展模式，并觀察到晚期進行性聽力損失,這有助于進一步探索p.V37I突變對遲發(fā)性聾的致病機制。

表2 GJB2基因突變相關(guān)的遲發(fā)性聾的動物模型Table 2 Mouse Models of Late-onset Hearing Loss with GJB2 Mutation

5 治療與干預(yù)

當新生兒基因檢測發(fā)現(xiàn)有GJB2基因突變時，無論出生時聽力篩查是否通過，均建議3月齡時進行聽力診斷[48]，并定期隨訪，了解聽力變化情況，以便早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。目前GJB2基因突變所致聽力損失的治療方法主要包括佩戴助聽器、中耳植入及人工耳蝸植入等。當患者出現(xiàn)中輕度聽力損失時可考慮佩戴助聽器進行聽力補償，若患者不能佩戴助聽器或助聽器效果欠佳，或有人工耳蝸植入禁忌癥的患者可考慮主動中耳植入（Active middle ear implants,AMEI），Brkic FF 等[49]對 103 例植入振動聲橋（Vibrant Soundbridge,VSB）的患者進行了約7.9年的長期隨訪，發(fā)現(xiàn)所有患者聽力改善明顯，效果滿意。當患者聽力損失為重度或極重度時，排除手術(shù)禁忌癥后，可考慮行人工耳蝸植入[50]。Kim SH[51]等對攜帶GJB2基因突變的耳聾患者人工耳蝸植入后的療效進行隨訪，發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后言語及聽力康復(fù)訓練表現(xiàn)良好，GJB2基因突變與否不會影響植入后患者的語音識別。

但以上治療方法在頻率敏感性、言語分辨及噪聲環(huán)境下仍存在許多缺陷。因此，內(nèi)耳的基因治療有可能成為新的遺傳性耳聾的治療方法。Lin X團隊[52]將改良的腺相關(guān)病毒載體接種到出生后早期條件性Gjb2基因敲除小鼠的耳蝸培養(yǎng)組織中，發(fā)現(xiàn)在耳蝸培養(yǎng)的細胞中有大量病毒表達的Cx26，并在突變小鼠耳蝸的Corti器官中重新建立了細胞間隙連接網(wǎng)絡(luò)，提示這可能是挽救Gjb2突變?nèi)狈π∈舐犃δ艿囊环N方法，也是未來人類治療干預(yù)的發(fā)展方向。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，GJB2突變可導致遲發(fā)性聾，突變種類多樣且具有一定的種族地區(qū)的差異性。GJB2突變相關(guān)的遲發(fā)性聾的發(fā)生發(fā)展機制可能與耳蝸主動放大功能受損、氧化應(yīng)激及自噬水平有關(guān)。隨著分子生物學技術(shù)不斷發(fā)展，GJB2基因的功能、特性及其與遲發(fā)性非綜合征性聾的關(guān)系與潛在致病機制將進一步明確，為GJB2突變相關(guān)遲發(fā)性聾患者的防治開辟新的途徑。