基因拷貝數(shù)變異在遺傳性耳聾研究中的進展

王秋權(quán) 黃莎莎 袁永一 康東洋 吳婕 張昕 戴樸

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心，聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室（北京 100853）

人類基因組上存在各種形式的遺傳變異和多態(tài)性，隨著各種基因工程技術(shù)的深入開展，單個核苷酸變異引起的多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）的突變機制及其與遺傳性疾病的關聯(lián)性更清晰明了，但其僅能闡明人類疾病復雜遺傳因素的一小部分。越來越多證據(jù)表明，拷貝數(shù)變異（Copy Number Variations,CNVs）可能解釋其余復雜遺傳因素。作為遺傳多樣性的一種普遍形式，CNVs被認為是與參考基因組相比，基因組DNA中大小為幾十個堿基（＞50bp）到幾Mb的DNA拷貝數(shù)變異現(xiàn)象，包括基因組重復、缺失、倒置和易位等，其中重復和缺失是最常見的[1]。

早在1959年，Lejeune及團隊就發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在長度大于5Mbp的基因變異[2]。2004年Iafrate小組和Sebat團隊分別報道人類基因組中CNVs以多態(tài)性廣泛存在，通過進一步分析發(fā)現(xiàn)其涉及的基因組區(qū)域包含許多參與調(diào)節(jié)細胞生長及代謝等功能的基因，且與多種出生缺陷疾病相關[3,4]。2006年,Redon團隊鑒定出涵蓋360Mbs大小，覆蓋人類基因組全長約12%，共計1447個拷貝數(shù)變異區(qū)，并發(fā)布第一代人類基因組CNVs圖譜[5]。千人基因組計劃也已發(fā)現(xiàn)了100萬個短插入或缺失和2萬個CNVs位點[6]，這極大程度地擴展了人類對遺傳學領域的認知?；蚪M變異數(shù)據(jù)庫（Database of Genomic Variants,DGV）整理并收錄了現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)報道的CNVs數(shù)據(jù)，目前發(fā)現(xiàn)CNVs約983845個，所覆蓋的基因組片段占人類基因組的29%以上，遠超SNPs。CNVs突變率大約是SNPs突變率的100～10000倍[7]，對基因組遺傳變異的多樣性具有重要意義（詳見表1）。相對SNPs的概念,將人群中等位基因頻率＞1%的CNVs定義為基因組拷貝數(shù)多態(tài)（Copy Number Polymorphisms,CNPs），超過90%的CNVs屬于這一類型，而頻率＜1%的CNVs稱為罕見CNVs[8]。

表1 CNVs與SNPs的比較Table 1 CNVs versus SNPs

在臨床上常見兩類CNVs：復發(fā)性CNVs和非復發(fā)性CNVs[9]。復發(fā)性CNVs斷裂點常位于包含大量片段重復的固定區(qū)域，所以這類CNVs在不同個體中的情況基本一致，大量的不同臨床表型被證實與復發(fā)性CNVs相關。與之不同，非復發(fā)性CNVs的斷裂點處于特定序列區(qū)域，難獲取準確序列數(shù)據(jù)，且微觀同源性較低，在端點連接處具有短插入或鈍端。部分致病性及非致病性CNVs屬于此類。大多數(shù)非復發(fā)性CNVs是簡單的刪除或串聯(lián)重復，但也有一些非常復雜，表現(xiàn)為數(shù)十個事件聚集在單個基因組區(qū)域中[10]。

1 CNVs的突變機制

目前提出的解釋大多數(shù)CNVs形成的機制主要有四種，包括非等位基因同源重組（Nonallelic Homologous Recombination,NAHR），非同源末端連接(Non-homologous End Joining,NHEJ)，復制叉停滯和模板轉(zhuǎn)換機制(Fork Stalling and Template Switching,FoSTeS)及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子驅(qū)動機制，對幾種主要機制特點及對比詳見表2。

表2 CNVs形成主要機制的特點及比較Table 2 Characteristics and comparison of the main mechanisms of CNVs formation

1.1 非等位基因同源重組

NAHR是由彼此具有高度同源性的兩個非等位基因DNA序列之間的比對和交叉引起的。據(jù)估計，大約28%的CNV可能通過NAHR形成而來[11]，是串聯(lián)重復和缺失的重要來源[12]。NAHR發(fā)生位點的分布存在重組熱點現(xiàn)象，即存在有順式作用基序（motif）“CCNCCNTNNCCNC”的富集[13]。NAHR可在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生帶有CNVs的配子，并可遺傳給后代[14]。

1.2 非同源末端連接機制

一些結(jié)構(gòu)簡單的CNVs則可能是源自NHEJ。NHEJ是修復哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Break，DSB)的關鍵機制，當雙鏈斷裂時，如果來自不同染色體的兩個片段連接在一起，就會導致基因缺失和重復。有研究表明，56%的CNVs由NHEJ引起的。其產(chǎn)生的CNVs斷點更集中于重復序列內(nèi)部或周圍,某些可以引起DSB或DNA彎曲的DNA基序（如TTTAAA）附近也比較容易出現(xiàn)CNVs。由于NHEJ發(fā)生時不需要高度同源性的DNA序列反應底物，并可能會有部分堿基插入連接處，這些使其與其他CNVs產(chǎn)生機制有所差異[15]。

1.3 復制叉停滯和模板轉(zhuǎn)換機制

2007年Lee通過對基因組重排的觀察，發(fā)現(xiàn)當DNA的復制叉停滯時，滯后鏈將會從模板上脫落，通過微同源序列轉(zhuǎn)到另一個空間位置上接近的復制叉重新開始合成DNA，從而導致拷貝數(shù)刪除或重復，而轉(zhuǎn)換和重新合成可能會連續(xù)發(fā)生多次，導致更復雜的重排，據(jù)此提出了FoSTeS模型。而新復制叉在起始復制叉的上下游決定CNVs的類型[16]。

1.4 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子驅(qū)動機制

在人體中，逆轉(zhuǎn)座子可在三個方面上介導CNVs形成。首先，人類基因組中的某些逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子仍然活躍，具有多態(tài)性，這些可被認為是CNVs本身[17]。其次，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座機制有時會導致加工過的mRNA整合回到基因組中，可能導致基因劑量的增加[18]。最后，逆轉(zhuǎn)座子可能改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)可塑性而促進大片段CNVs的形成[19]。

2 CNVs與遺傳性耳聾的相關研究

聽力損失是臨床上最常見的致殘性疾病之一，全球約有4.66億人口因聾致殘，約占全球人口的5%，每1000個新生兒中就有2-3名耳聾或聽力障礙患者,其中大約50%-60%是由遺傳因素引起的[20,21]，作為基因組變異的一種重要表現(xiàn)形式，CNVs也在遺傳性耳聾的多基因遺傳研究中越來越多的被發(fā)現(xiàn)。

早在1998年，Laer等人在DNFA5基因座上發(fā)現(xiàn)了一個插入/缺失突變，這是首次報道CNVs導致非綜合征耳聾的文章[22]。2001年，Verpy等人通過候選耳聾基因方法發(fā)現(xiàn)STRC基因存在大片段的刪除[23]。2012年，F(xiàn)rancey等人鑒定出17個STRC基因缺失，發(fā)現(xiàn)大片段CNVs是STRC基因的主要突變類型[24]。據(jù)評估，在日本散發(fā)的明確遺傳因素的中重度感音神經(jīng)性聾患兒中，約1/3與STRC基因CNVs有關[25]。越來越多的研究證實CNVs是遺傳性耳聾的常見原因之一，2014年Richard研究組發(fā)表的第一篇CNVs在遺傳性耳聾的大宗病例報道，發(fā)現(xiàn)在明確分子病因的患者中CNVs參與致病者占18.7%，涉及16個基因的143種CNVs[26]。同年，復旦大學李華偉團隊應用二代測序技術(shù)對79名散發(fā)耳聾患者進行檢測，在27個耳聾基因中發(fā)現(xiàn)了CNVs[27]。

OTOA基因被認為是第二常見的受CNVs影響的耳聾基因，已有近30個在不同種族人群導致聽力損失的OTOA基因缺失CNVs被報道[28]。在綜合征型耳聾基因中也發(fā)現(xiàn)了大量CNVs，如覆蓋EYA1基因的18q13基因片段上發(fā)生的缺失CNVs正是腮耳腎綜合征的病因之一，EYA1基因部分外顯子的重復也可導致此綜合征的發(fā)生[29,30]。此外，至少有50個CNVs發(fā)生在USU2A基因上而導致Usher綜合征[31]。截至目前已有64個耳聾基因被報道發(fā)生CNVs。在雙側(cè)耳聾患者中，20%的致聾基因被鑒定為存在CNVs，15%接受基因檢測的患者攜帶有CNVs[32]。

3 遺傳性耳聾CNVs的致病機制

目前研究表明，人類基因組CNVs并不是隨機分布,近40%的CNVs更傾向分布于基因沙漠區(qū)，但仍有大量疾病易感基因或致病基因定位于CNVs區(qū)域，可解釋多達20%的個體異常表型[5,33]。CNVs可通過基因破壞、基因融合、劑量效應、位置效應等機制導致疾病[34]。

CNVs可直接對聽力功能所必需的蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生有害影響,從而導致耳聾。當CNVs累及整個基因時會導致耳聾發(fā)生，如當OTOA基因發(fā)生純合缺失時，其編碼序列缺失而無法編碼Otoancorin蛋白，使耳蝸蓋膜發(fā)生異常導致耳聾[35]；當基因調(diào)控/啟動子區(qū)發(fā)生CNVs時也會引起耳聾，POU3F4基因僅在上游增強子區(qū)域發(fā)生CNVs時便可導致內(nèi)耳發(fā)育異常[36]。此外，CNVs可能會導致隱性基因暴露，如當TMPRSS3基因雜合變異時，復雜的基因組重排導致基因破壞，產(chǎn)生無效等位基因而導致耳聾[37]。

由于CNVs片段長度比較長，可能涵蓋數(shù)個基因，且其結(jié)構(gòu)復雜，因此其也可能通過影響分子表型或基因組表型異質(zhì)性，進而導致耳聾發(fā)生，所以需要更好的了解CNVs對基因表達的影響，以評估其在遺傳性耳聾復雜性狀中的作用。

CNVs導致遺傳性耳聾所涉及的具體基因及機制仍需進一步的分析和驗證。對遺傳性耳聾來說，有學者提出致病性CNVs應被定義為：1)覆蓋已知致聾基因的編碼區(qū)，臨床表型及遺傳模式與已報道的該基因表型及模式吻合；2)覆蓋已知的致病CNVs；3)新發(fā)的CNVs或在多個受累家庭成員中發(fā)現(xiàn)已知引起疾病的基因突變與表型共分離CNVs；4)位于一個基因富集的區(qū)域；5)具有大片段的變異，CNVs處于特異的、富含基因序列的區(qū)域；6)為稀有CNVs，在內(nèi)部數(shù)據(jù)庫/公共數(shù)據(jù)庫人群攜帶率＜1%[38]。

4 CNVs的檢測方法

近年來，研究人員提出了很多與標準參照基因進行比較的CNVs檢測技術(shù),以確定變異區(qū)域的拷貝數(shù)及斷點位置為其重點研究方向,但不同的檢測方法及其應用的計算策略在變異類型和CNVs拷貝數(shù)鑒定，及斷點位置準確度等方面各有優(yōu)劣[39]。

實時熒光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitive Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR）是首先用于目標區(qū)域CNVs的檢測技術(shù),其敏感性高，操作簡單，污染少，重復性好，但其不能進行高通量CNVs檢測。多重鏈接探針擴增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）是對待檢DNA靶序列進行定性和半定量分析的檢測技術(shù)，具有通量高，靈敏度高,特異性強，可重復性好的特點，但其只能檢測已知序列，且探針的特異性要求高，無法檢測出易位、倒位等情況。染色體微陣列分析技術(shù)中常用的微陣列比較基因組雜交（Array-based Comparative Genomic Hybridization，aCGH）技術(shù)使用雙雜交策略檢測待測樣本位點的拷貝數(shù)變化，由于其可同時分析數(shù)萬個基因，因此被廣泛地應用于全基因組CNVs檢測及產(chǎn)前診斷CNVs檢測中，但其不能檢測到倒位、易位及低水平的嵌合體，也無法檢測斷點信息，且對單拷貝數(shù)不敏感。下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)，其具有高通量及高分辨率的特性，可對CNVs進行深度挖掘，精確定位和鑒定，除此之外其還可檢測到覆蓋全染色體非整倍體、大及更低比例的嵌合，基于NGS的CNV-seq也越來越多地應用于產(chǎn)前診斷中[40]。但其受限于讀長短特性，并易受覆蓋率影響，很難檢出較小的CNVs，且對斷點的精確定位仍存在困難。

目前，檢測技術(shù)都具有一定優(yōu)勢及不足，僅使用一種方法還不能完全的檢測出一個個體基因組所包含的所有CNVs。測序技術(shù)正朝通量更高，讀長更長，精度更高和成本更低的方向發(fā)展，如基于納米孔測序原理的第三代測序技術(shù)(Third Generation Sequencing，TGS)，其不再需要PCR擴增過程，可對每一條DNA分子進行單獨測序，更好地解決復雜重復序列、高GC等問題。由于其長讀長的特性，可準確檢測CNVs，確定CNVs片段參考數(shù)據(jù)，更可以精確地定位CNVs的準確位置，找到確切斷點信息[41]。

5 小結(jié)及展望

人類基因組中存在大量的CNVs,遺傳效應遠大于SNPs，對CNVs的研究更有助于對基因組變異與疾病間關系的深入理解。對于CNVs和耳聾基因突變的綜合作用，尤其是在正常聽力個體中CNVs多態(tài)性的認識，我們?nèi)蕴幱谠缙陔A段。隨著對CNVs研究方法及檢測技術(shù)的發(fā)展，可使我們更深入了解耳聾相關致病基因CNVs的致病機制，進一步理解遺傳性耳聾的表型及遺傳變異之間的關系，為遺傳性耳聾患者群體提供更有價值的分子診斷信息，指導臨床發(fā)現(xiàn)新的治療方法，以及制定更好的預防策略。