斑馬魚模型評(píng)價(jià)抗真菌藥物的耳毒性

諶晶晶 徐慧芳 唐旭霞

浙江省中醫(yī)院耳鼻咽喉科（杭州 31006）

真菌性外耳道炎是真菌感染外耳道皮膚所致的炎性病變，多局限在外耳道，但也可通過(guò)穿孔的鼓膜侵及中耳或開(kāi)放的乳突腔。其癥狀常表現(xiàn)為耳道瘙癢、溢液、耳脹及聽(tīng)力下降等。最常見(jiàn)的致病菌是白色念珠菌和曲霉菌[1-3]。

真菌性外耳道炎的治療除清潔外耳道，保持外耳道干燥外，局部抗真菌藥物的使用也很重要。氟康唑、聯(lián)苯芐唑及制霉菌素這三種抗真菌藥在臨床工作中使用率較高。氟康唑和聯(lián)苯芐唑?qū)儆谶蝾惪拐婢帲泼咕貙儆诙嘞╊惪拐婢帲瑑烧呔袕V譜抗菌作用。前者通過(guò)阻斷麥角甾醇的合成而破壞真菌細(xì)胞壁的完整性，抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖，后者通過(guò)改變真菌細(xì)胞壁通透性發(fā)揮作用。局部用抗真菌藥劑型主要有軟膏、凝膠、乳膏和水劑。有研究顯示軟膏可能刺激中耳黏膜形成肉芽。相比其他劑型，水劑更容易到達(dá)外耳道深部，特別是在外耳道充血腫脹的情況下。因此，水劑更適合真菌性外耳道炎。但在鼓膜置管、鼓膜穿孔及實(shí)施過(guò)乳突開(kāi)放術(shù)的情況下，滴耳液就有可能進(jìn)入中耳，進(jìn)而通過(guò)圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳，對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的功能造成不同程度的影響[4-6]。因此，對(duì)抗真菌藥物耳毒性的研究非常必要。

斑馬魚為低等脊椎動(dòng)物，其產(chǎn)卵量大，繁殖周期短，胚胎身體透明，可以在顯微鏡下觀察其給藥前后組織器官的變化情況。因而，近年來(lái)，斑馬魚被廣泛應(yīng)用于藥物的藥理及毒性研究[7，8]。斑馬魚雖然沒(méi)有外耳及中耳，但具有典型的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，其內(nèi)耳毛細(xì)胞及分布在身體側(cè)線神經(jīng)丘上的毛細(xì)胞在功能和形態(tài)上與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞極為相似[9]。通過(guò)特異的免疫熒光染色，能很好的觀察藥物對(duì)毛細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)將利用斑馬魚來(lái)研究氟康唑、聯(lián)苯芐唑、制霉菌素的耳毒性，以期建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速、直觀地檢測(cè)抗真菌藥物耳毒性的斑馬魚模型和方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行。每次交配準(zhǔn)備4～5對(duì)成年，AB品系斑馬魚，平均每對(duì)能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6小時(shí)（即6 hpf）和24 hpf對(duì)胚胎進(jìn)行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎（養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH 為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6 mg/L CaCO3）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥，儀器與試劑

氟康唑(批號(hào)A536904)、聯(lián)苯芐唑（批號(hào)150618041）、制霉菌素（批號(hào)L1510124）及慶大霉素（阿拉丁，批號(hào)39970）用0.1%的二甲基亞砜（DMSO）分別配制成儲(chǔ)備液，-20℃保存儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)前根據(jù)所需濃度進(jìn)行稀釋。

熒光立體顯微鏡（Nikon AZ 100,Japan）；解剖顯微鏡(Olympus SZX7,Japan)；6孔板（Nest Biotech）；二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號(hào)1095515）；DASPEI染料（sigma，批號(hào)109k1336）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 確定三種藥物的最大非致死濃度（MNLC）及10%的致死濃度（LC10）

三種藥物的初始檢測(cè)濃度均設(shè)計(jì)為0.1，1，10，100和500 μg/mL。分別用上述濃度各處理30尾6hpf（受精后6小時(shí)）的斑馬魚至5 dpf（受精后5天），每天更換藥水并清除死亡斑馬魚。最后，統(tǒng)計(jì)每種藥物不同濃度下6hpf至5 dpf斑馬魚總的死亡數(shù)量，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 6.0繪制最佳的濃度效應(yīng)曲線，經(jīng)過(guò)曲線擬合，分別計(jì)算出三種藥物的MNLC和LC10。如果上述初始檢測(cè)濃度無(wú)法得出MNLC及LC10，則進(jìn)一步測(cè)試藥物濃度低至0.01μg/mL或高至1000 μg/mL。

1.2.2 評(píng)價(jià)藥物的耳毒性

實(shí)驗(yàn)組：每種藥物選取4個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)（LC10、MNLC、1/3 MNLC 和1/10 MNLC）；陽(yáng)性對(duì)照組（慶大霉素組）：5μg/ml的慶大霉素；陰性對(duì)照組：養(yǎng)魚用水；溶劑組：0.1% DMSO[10]。各組均處理30尾6hpf的斑馬魚至5dpf。

（1）分別于3dpf和5dpf在顯微鏡下觀察斑馬魚平衡囊及軀干形態(tài)的變化，拍照并保存。

（2）用毛細(xì)胞特異性熒光染料DASPEI對(duì)5dpf的斑馬魚進(jìn)行染色。每組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘及頭部5個(gè)神經(jīng)丘(O1,O4,MI1,MI2,IO4)毛細(xì)胞的分布和排列，用圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，一方面計(jì)算毛細(xì)胞熒光強(qiáng)度（S），另一方面數(shù)出頭部5個(gè)神經(jīng)丘的毛細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

斑馬魚的毛細(xì)胞損傷率計(jì)算公式如下：

毛細(xì)胞損傷率（%）=（S(溶劑組)-S（化合物組））/S（溶劑組）×100%采用單因素方差分析及Dunnett’s T檢驗(yàn)比較各組間的差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MNLC和LC10

三種藥物的初始測(cè)試濃度及斑馬魚死亡率見(jiàn)表1，通過(guò)表1中的藥物濃度擬合出最佳濃度效應(yīng)曲線（R2＞0.99），如圖 1，得出藥物的 MNLC 和LC10。氟康唑、聯(lián)苯芐唑、制霉菌素的MNLC分別為653.8μg/mL,0.37μg/mL和10.5μg/mL，LC10分別為705.4μg/mL,0.52μg/mL和11.8μg/mL。

表1 藥物濃度及斑馬魚死亡率（n=30）Table 1 The concentration of antifungal drugs and mortality of zebrafish（n=30）

2.2 平衡囊及軀干形態(tài)的變化

三種抗真菌藥及慶大霉素組均出現(xiàn)明顯的斑馬魚耳毒性，表現(xiàn)為球囊和橢圓囊大小、形態(tài)發(fā)生改變，軀干屈曲（見(jiàn)圖2，圖3）。

圖2 斑馬魚平衡囊形態(tài)的變化Fig.2 Toxicity of antifungal drugs on statocyst

圖3 斑馬魚軀干形態(tài)的變化Fig.3 Toxicity of antifungal drugs on trunk(prone position)

2.3 毛細(xì)胞的變化

根據(jù)斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘及平衡囊周圍神經(jīng)丘（O1,O4,MI1,MI2,IO4）的免疫熒光強(qiáng)度，可計(jì)算出毛細(xì)胞的損傷率，如表2。與陰性對(duì)照組比較，慶大霉素組及三種抗真菌藥物組斑馬魚毛細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001。

表2 各組毛細(xì)胞的免疫熒光強(qiáng)度及毛細(xì)胞損傷率（n=10）Table 2 The hair cells fluorescence intensity and loss rate of zebrafish in different groups（n=10）

為進(jìn)一步分析抗真菌藥物對(duì)毛細(xì)胞的影響，數(shù)出著色的神經(jīng)丘O1,O4,MI1,MI2,IO4毛細(xì)胞數(shù)量，與陰性對(duì)照組比較。結(jié)果顯示每個(gè)神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖4。

圖4 神經(jīng)丘O1,O4,MI1,MI2,IO4毛細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.4 The changes in the number of the hair cells treated with antifungal drugs

3 討論

2005年，Ton等提出藥物的斑馬魚耳毒性與對(duì)人內(nèi)耳的毒性存在相關(guān)性[11]。利用斑馬魚來(lái)研究氨基糖甙類抗生素及抗腫瘤藥物順鉑等耳毒性的實(shí)驗(yàn)證明斑馬魚是良好的篩查藥物耳毒性的模型[12-16]。2008年，Chiu等使用斑馬魚模型篩查了FDA批準(zhǔn)使用的1040種藥物，發(fā)現(xiàn)21種藥物具有斑馬魚耳毒性，其中2種藥物的毒性作用在進(jìn)一步的大鼠實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)[9]。證明了斑馬魚在篩查藥物耳毒性方面的價(jià)值。1957年，學(xué)者Schuknechtin首次提出滴耳液可能存在耳毒性[17]。隨后，使用滴耳液導(dǎo)致聽(tīng)力損失的病例時(shí)有報(bào)導(dǎo)，相關(guān)藥物的耳毒性研究也越來(lái)越多[18-20]。

本研究對(duì)臨床中常用的三種抗真菌藥物-氟康唑、聯(lián)苯芐唑、制霉菌素-進(jìn)行耳毒性的篩查,發(fā)現(xiàn)三種藥物均具有斑馬魚耳毒性，并且存在劑量依賴關(guān)系，包括改變球囊、橢圓囊的大小，神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量減少，斑馬魚身體側(cè)翻。身體的屈曲及側(cè)翻可能跟平衡囊毛細(xì)胞受到損傷進(jìn)而影響其功能相關(guān)。該模型可快速、靈敏地篩查出抗真菌藥物的耳毒性。本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)苯芐唑的致死濃度最低，氟康唑的致死濃度最大，說(shuō)明即使同屬于唑類抗真菌藥，造成斑馬魚毒性作用的藥物濃度也是不一樣的。回顧文獻(xiàn)，尚無(wú)利用斑馬魚來(lái)研究上述三種抗真菌藥物耳毒性的實(shí)驗(yàn)。少量抗真菌藥物耳毒性的實(shí)驗(yàn)則是使用哺乳動(dòng)物。Tom LW利用豚鼠對(duì)克霉唑、咪康唑、制霉菌素耳毒性的研究示該三種抗真菌藥處理后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量并無(wú)減少[21]。Süleyman ?zdemir利用白鼠對(duì)奧西康唑耳毒性的研究示奧西康唑處理后白鼠的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）幅度并無(wú)改變[2]。Tom LW的研究使用電鏡直接觀察毛細(xì)胞數(shù)量的改變，與本研究有相似之處，克霉唑、咪康唑與氟康唑、聯(lián)苯芐唑同屬唑類抗真菌藥，但Tom LW等發(fā)現(xiàn)豚鼠的毛細(xì)胞數(shù)量并無(wú)減少，而本實(shí)驗(yàn)中氟康唑、聯(lián)苯芐唑處理后的斑馬魚毛細(xì)胞均有不同程度的減少?？赡茉蚴?.實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度不一樣，本研究中選用1/10MNLC,1/3MNLC,MNLC和LC10的藥物濃度，而Tom LW的研究直接選用1%的克霉唑水劑和2%的咪康唑乳膏；2.藥物進(jìn)入內(nèi)耳的途徑不一樣，豚鼠屬哺乳動(dòng)物，有外耳、中耳及內(nèi)耳，藥物需經(jīng)過(guò)中耳滲透進(jìn)入內(nèi)耳，而斑馬魚無(wú)中耳結(jié)構(gòu)，藥物直接從表皮滲透進(jìn)入內(nèi)耳。奧西康唑也屬于唑類抗真菌藥，Süleyman ?zdemir等的研究證明奧西康唑?qū)Π资鬅o(wú)耳毒性，但所采用的評(píng)估方式是對(duì)比DPOAE幅度的改變。DPOAE幅度無(wú)改變說(shuō)明藥物對(duì)毛細(xì)胞整體的功能無(wú)影響，而是否造成了毛細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的損傷或壞死未可知。

盡管本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氟康唑、聯(lián)苯芐唑及制霉菌素均具有斑馬魚耳毒性，但并不能直接證明其對(duì)人耳具有毒性作用。原因有以下幾方面：1.滴耳液通常用于處于炎癥狀態(tài)的皮膚、黏膜，炎癥導(dǎo)致的中耳黏膜水腫、滲出，甚至膿性分泌物均能阻擋藥物進(jìn)入內(nèi)耳[22]；2.正常中耳黏膜非常薄，而炎癥狀態(tài)的黏膜較厚，降低了黏膜的滲透性，從而減少藥物的滲入[23]；3.斑馬魚無(wú)外耳和中耳，缺少中耳黏膜的阻擋。另外，斑馬魚屬于脊椎動(dòng)物，藥物的代謝過(guò)程不同于哺乳動(dòng)物，并且斑馬魚的毛細(xì)胞能在藥物去除后再生，藥物還可通過(guò)斑馬魚皮膚、吞咽等吸收進(jìn)入體內(nèi)[11]。因此，進(jìn)一步在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的研究非常必要。

不足之處：本文側(cè)重形態(tài)學(xué)，沒(méi)有電生理學(xué)研究資料，稍顯不足；其次，本研究?jī)H初步探索了三種抗真菌藥物的耳毒性現(xiàn)象，而未對(duì)其導(dǎo)致毛細(xì)胞損害的機(jī)制進(jìn)行深入的研究。在接下去的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。

4 結(jié)論

1.三種抗真菌藥物均具有斑馬魚耳毒性，導(dǎo)致斑馬魚平衡囊軀干形態(tài)發(fā)生改變，均導(dǎo)致斑馬魚毛細(xì)胞數(shù)量的減少，并存在劑量依賴關(guān)系。2.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究制霉菌素、氟康唑、聯(lián)苯芐唑?qū)Π唏R魚幼體毛細(xì)胞的損傷作用，建立了一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速、直觀地檢測(cè)抗真菌藥物耳毒性的斑馬魚模型和方法。