基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的藍芩口服液治療新型冠狀病毒肺炎的分子機制研究

李研達，曾煜，劉旺

1.湛江市中心人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東 湛江524000；2.廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣東 湛江524000

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)簡稱“新冠肺炎”，在全球范圍內(nèi)爆發(fā)[1]。COVID-19被證實為一種主要經(jīng)飛沫或接觸傳播的急性呼吸道傳染病，其具有潛伏期長、傳染性強、人群普遍易感的特點[2]。雖然目前我國疫情已明顯好轉(zhuǎn)，確診病例增長腳步明顯放緩，但近期在多地仍有少數(shù)本土確診病例被報道。國外疫情防控形勢相比較于我國更加嚴峻，尤其是美國、巴西等歐美國家，確診病例仍迅速增長，其中意大利和西班牙的新冠肺炎總體死亡率更是超過10%，新冠肺炎已成為嚴重影響人類健康的社會問題。目前我國發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》指出，目前尚無針對新冠肺炎的特效藥物[3]，但中醫(yī)中藥憑借其在疾病中辨證論治方面的特點，不論是在以往的非典型肺炎還是如今我國防控新冠肺炎疫情方面都起到了重要的作用。

藍芩口服液是由板藍根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子等中藥組合而成的中藥制劑，由于其具有抗病毒、清熱解毒、消炎止痛等作用，目前已在臨床上被廣泛應用于治療上呼吸道感染、慢性咽炎等多種疾病中[3]?！稄V東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》推薦藍芩口服液用于疑似病例及早期確診病例的治療[4]。板藍根具有清熱解毒、消炎利腫的功效，能在體內(nèi)阻斷病毒復制和繁殖，具有明確的抗病毒功能[5]。黃柏味苦、性寒，有清熱、燥濕、解毒、療瘡之功，并且對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細菌有抑制作用[3]。黃芩味苦、性寒，有瀉火、解毒、止血、安胎之功效，可在體內(nèi)抑制腺病毒及流感病毒的復制及播散[6]。胖大海味甘、性涼，現(xiàn)代藥理學表明其具有抗病毒、抗炎癥反應、抑制細菌繁殖的作用，并且可增強脾臟及胸腺的功能，參與調(diào)節(jié)機體的免疫功能[7]。梔子味苦、性寒，有清熱、瀉火、涼血之功效，在抑制炎癥滲出、抗金黃色葡萄球菌、鎮(zhèn)痛等多個方面均發(fā)揮作用[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是在傳統(tǒng)藥理學的基礎(chǔ)上整合計算機網(wǎng)絡(luò)科學、分子生物學等多個學科的一門新興學科，其主要強調(diào)藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預，從整體上探索藥物與機體之間的相互作用關(guān)系，反映了多組分、多靶點和系統(tǒng)調(diào)控的思想，與中醫(yī)中藥的辨證論治和整體觀念有著相似之處[9]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學探索藍芩口服液治療COVID-19的分子機制，為COVID-19治療藥物的研發(fā)和臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 藍芩口服液主要活性成分篩選TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)是一個可用于探索藥物、靶標和疾病之間的關(guān)系的中草藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫[10]。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以藍芩口服液的主要5味中藥藥材板藍根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18及半衰期(half-Life，HF)≥4為篩選標準，篩選藍芩口服液的主要活性成分。

1.2 藍芩口服液主要活性成分作用基因靶點及COVID-19相關(guān)基因靶點收集Related Targets功能是TCMSP數(shù)據(jù)庫的功能之一，可用于預測得到的藍芩口服液的主要活性成分的作用靶點信息，使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對活性成分作用靶點信息進行校正及標準化得到對應的基因靶點[11]。使用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫[12]，以“Novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，檢索得到新型冠狀病毒肺炎的相關(guān)基因靶點。對藍芩口服液主要活性成分作用基因靶點及疾病相關(guān)基因靶點使用韋恩圖取交集得到共同基因靶點，此共同基因靶點即為藍芩口服液治療COVID-19的基因靶點。

1.3 藥材-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)與共同基因靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將板藍根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子這五味中藥與其主要活性成分及相關(guān)作用靶點信息導入Cytoscpe 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)[13]軟件中，構(gòu)建藥材-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。將“1.2”中韋恩圖得到的共同基因靶點導入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)[14]數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建共同基因靶點的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 共同基因靶點GO與KEGG通路富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫是對基因功能進行注釋的常用數(shù)據(jù)庫，使用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)[15]數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，對共同基因靶點進行基因本體論(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5為截斷值標準，以進一步了解藍芩口服液治療COVID-19的分子信號通路。GO分析由三個方面組成，分別是生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，是對基因的本質(zhì)進行闡述。KEGG通路富集分析有助于了解某一基因或者某一蛋白質(zhì)所參與信號通路過程及其在信號通路過程中所處的地位。

2 結(jié)果

2.1 藍芩口服液的主要活性化合物 本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18及HL≥4為篩選標準，共篩選得到藍芩口服液的主要活性成分104種，其中板藍根30種，黃柏27種，黃芩32種，胖大海4種，梔子11種，去除重復項后共得到91種主要活性成分。各活性成分以O(shè)B值按大小排序，使用表格對OB值排名前20的活性成分進行展示，如表1所示。

2.2 藍芩口服液主要活性成分作用靶點及疾病相關(guān)靶點 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫對藍芩口服液主要活性成分的作用靶點進行預測，經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫對相關(guān)作用靶點信息進行標準化和基因名稱注釋及去除重復值后，共得到205個作用基因靶點，其中作用靶點數(shù)目排名前5的活性成分分別為MOL000098-quercetin(槲皮素)、MOL000358-beta-sitosterol(β-谷甾醇)、MOL000449-Stigmasterol(豆甾醇)、MOL000422-kaempferol(山奈酚)、MOL000173-wogonin(漢黃芩素)。新冠肺炎相關(guān)基因靶點信息通過使用Gene Cards數(shù)據(jù)庫，以“Novel coronavirus pneumonia”為檢索詞檢索得到，共得到疾病相關(guān)基因靶點259個。使用韋恩圖將活性成分作用基因靶點與COVID-19相關(guān)基因靶點取交集后得到共同基因靶點43個即為藍芩口服液治療COVID-19的基因靶點，如圖1所示。

圖1 藍芩口服液治療COVID-19基因靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape

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3.7.2 軟件對板藍根、黃柏、黃芩、胖大海、梔子這五味中藥藥材及其活性成分、作用靶點構(gòu)建藥材-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含282個節(jié)點和1272條邊(5個中藥藥材節(jié)點，74個活性成分節(jié)點，205個基因靶點節(jié)點)，其中黃色三角形代表板藍根(Isatidis Radix)、黃柏(Phellodendri Chinrnsis Cortex)、黃芩(Scutellariae Radix)、胖大海(Sterculiae Lychnophorae Semen)、梔子(Gardeniae Fructus)這五味中藥藥材，綠色六邊形代表各中藥藥材所對應的主要活性成分，藍色圓形代表五味中藥藥材的共同活性成分，紅色菱形代表205個基因靶點(圖2)。使用STRING數(shù)據(jù)庫，對“2.2”中得到的藍芩口服液治療COVID-19的基因靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含43個節(jié)點和513條邊，每個節(jié)點代表靶點蛋白，每條邊代表靶點蛋白與其他靶點蛋白間的相互作用關(guān)系。度值可反應某個靶點蛋白與其他靶點蛋白相互作用關(guān)系的強弱從而提示靶點在網(wǎng)絡(luò)中的地位，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，度值排名前10的靶點分別為：絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白介素6(interleukin 6，IL6)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、白介素10(interleukin 10，IL10)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、CXC趨 化 因 子 配 體8(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL8)、CC型修飾趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)、白介素1B(interleukin 1B，IL1B)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、干擾素γ(Interferon-gamma，IFNG)，藍芩口服液很有可能通過作用于這些靶點在治療COVID-19中發(fā)揮作用。

2.4 共同基因靶點的功能富集分析 本研究中使用DAVID數(shù)據(jù)庫對基因靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5為截斷值標準，對GO每個富集項目中富集基因數(shù)目排名前5的注釋條目使用柱狀圖進行可視化(圖4)，對KEGG通路富集分析中富集基因數(shù)目排名前20的注釋條目使用柱狀圖進行可視化(圖5)。GO富集分析顯示，共同基因靶點在生物學過程、細胞組分和分子功能這三個方面富集的條目分別是30、10、7，其中包括了炎癥反應、藥物反應、免疫反應、凋亡過程、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶的結(jié)合等多個方面，提示藍芩口服液可能通過參與多個生物學途徑的調(diào)節(jié)對COVID-19的治療產(chǎn)生影響。KEGG通路富集分析顯示共同基因靶點富集在包括癌癥通路、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路、Toll樣受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在內(nèi)的59個KEGG信號通路。

圖2 藍芩口服液中藥材-活性成分-作用基因靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 藍芩口服液藍芩口服液治療COVID-19靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 藍芩口服液治療COVID-19基因靶點GO富集分析

圖5 藍芩口服液治療COVID-19基因靶點KEGG通路富集分析

3 討論

COVID-19因具有潛伏期長、傳染性強、傳播迅猛的特點，在中醫(yī)學中歸屬于“疫病”范疇[3]。自古以來我國對于疫病的病因、病機、防控及治療等方面有著較為完善的理論體系，一代代醫(yī)家學者在通過不斷探索與實踐，在疫病診療的各個方面都積累了豐富的經(jīng)驗。有臨床研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COVID-19能減輕患者的臨床癥狀，縮短疾病病程，提高治愈率的特點[16]。

在《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》中，對于新冠肺炎的病因病機，可總結(jié)為以肺為病變之重心，可輻射至脾、腎、胃等多個器官，其病機特點為熱、濕、瘀、毒、虛，在該方案中藍芩口服液被推薦用于以外感發(fā)熱為主要癥狀的疑似病例及以乏力、咽痛、口干、干咳少痰等為主要臨床表現(xiàn)的早期確診病例中[3]。因此，本研究試圖通過網(wǎng)絡(luò)藥理學進一步挖掘藍芩口服液的主要活性成分及其在治療COVID-19中的分子機制。

本研究應用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，共篩選出藍芩口服液中主要活性成分91種以及相對應的作用基因靶點205個，其中作用靶點數(shù)目排名前5的活性成分分別為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、漢黃芩素。槲皮素是一種黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學表明，槲皮素在抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及降糖、降脂等多個方面均有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制包括IL6、IL10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時還可通過鈣穩(wěn)態(tài)途徑抑制巨噬細胞中炎癥因子的釋放，從而在炎癥反應中發(fā)揮作用[18]。漢黃芩素也是一種黃酮類化合物，在體內(nèi)補體系統(tǒng)的過度激活中有著抑制作用，對于甲型流感病毒所致的急性肺損傷具有改善作用[19]。研究表明β-谷甾醇在抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多方面具有重要作用，還可以通過抑制TNF-α-NF-κB信號通路起到改善肝臟纖維化、保護肝功能的作用[20]。山奈酚同樣是一種具有抗炎、抗菌、抗病毒等多種功效的黃酮類化合物，在抗菌、抗病毒方面，有研究報道了山奈酚對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、霍亂弧菌、乙型肝炎病毒均有抑制作用，同時亦可通過抑制炎癥因子的表達發(fā)揮著抗炎癥反應的作用[21]。

在藍芩口服液治療COVID-19的基因靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中，MAPK8、IL6、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、PTGS2、IFNG處于核心地位可能是藍芩口服液治療COVID-19的主要作用靶點，其中IL6、IL10、IL1B與炎癥反應相關(guān)，MAPK8與MAPK1是MAPK家族成員，可在癌癥、病毒感染等多種應激條件下被激活，從而產(chǎn)生逐級磷酸化，在炎癥反應、細胞增殖分化、細胞凋亡等多個方面發(fā)揮作用[22]。CCL2、CXCL8均屬于趨化因子家族成員，同時CCL2與CXCL8又都屬于炎性趨化因子，在炎癥反應中有著重要作用[23]。CCL2在免疫調(diào)節(jié)中起到調(diào)控巨噬細胞的吞噬作用及調(diào)控T淋巴細胞產(chǎn)生抗體的作用[24]。有研究表明，CCL2可通過促進HIV-1病毒的復制進而促進了艾滋病的發(fā)展[25]。

通過對藍芩口服液治療COVID-19的基因靶點GO和KEGG富集分析，可以觀察到，藍芩口服液治療COVID-19涉及多個生物學過程和分子信號通路，提示了藍芩口服液在治療COVID-19中有著多靶點調(diào)控，多方面作用的特點。其中KEGG富集分析結(jié)果顯示，藍芩口服液主要活性成分作用基因靶點參與了癌癥通路、南美錐蟲病、甲型流感通路、肺結(jié)核通路、TNF信號通路、乙型肝炎通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路等信號通路，不難發(fā)現(xiàn)，上述通路涉及了病毒感染、細菌感染、免疫調(diào)控、炎癥反應等多個方面。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學的角度，篩選與分析了藍芩口服液治療COVID-19的相關(guān)作用靶點及其相關(guān)分子信號通路，說明了藍芩口服液在治療COVID-19上有著多靶點調(diào)控、多方面作用的特點。在藍芩口服液中，5味主要中藥材均屬性寒、性涼一類的藥材，如長期或大量服用可傷脾胃，故在治療COVID-19時應注意辨證論治，同時網(wǎng)絡(luò)藥理學有著一定的局限性，后續(xù)應對各藥材的主要活性成分及相關(guān)靶點、信號通路做進一步實驗驗證，從而為后期COVID-19藥物的開發(fā)提供依據(jù)。