糖尿病無癥狀性心肌缺血患者血清孤啡肽與脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2水平變化的研究

解夢(mèng)莉，蘇敬，李靜，韓毅

冠心?。–HD）的發(fā)生與脂質(zhì)斑塊沉積、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的活動(dòng)有關(guān)。無癥狀性心肌缺血（SMI）又稱為隱匿型冠心病，因其缺乏臨床癥狀而不易被發(fā)現(xiàn)，往往引起更為嚴(yán)重的后果。糖尿病是心血管疾病的公認(rèn)危險(xiǎn)因素。研究表明，糖尿病患者SMI的發(fā)生率為12%～34%［1?2］。美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃（NCEP）成人治療組Ⅲ指南提出，糖尿病作為冠心病等危癥，其10 年內(nèi)患CHD 風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到20%，且患CHD 后病死率較高［3］。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp?PLA2）是近期發(fā)現(xiàn)的一種預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈疾病的指標(biāo)，可能參與SMI 的發(fā)生［4］。內(nèi)源性孤啡肽（N/OFQ）與多種心血管疾病有關(guān)。Fontana等［5］發(fā)現(xiàn)急性不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿N/OFQ 水平升高。Guo 等［6］研究發(fā)現(xiàn)急性冠狀動(dòng)脈疾病可以影響N/OFQ水平，均提示N/OFQ可能與心肌缺血有關(guān)，然而目前N/OFQ 與糖尿病合并SMI 的關(guān)系仍不明確。本研究主要分析N/OFQ、Lp?PLA2 與糖尿病合并SMI的關(guān)系，為防治糖尿病合并SMI提供新的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年5月—12月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院擇期行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)的糖尿病患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡55～70 歲。（2）經(jīng)內(nèi)分泌專科醫(yī)師依據(jù)《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017年版）》［7］診斷為2型糖尿病。（3）高血壓患者血壓控制良好達(dá)5年以上，高脂血癥患者血脂控制良好，高血壓定義為收縮壓超過140 mmHg 和（或）舒張壓超過90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）使用抗高血壓藥物。高脂血癥定義為總膽固醇水平超過6.2 mmol/L和（或）進(jìn)行調(diào)脂治療。糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）、糖尿病腎?。―N）、糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017年版）》［7］。SMI 診斷標(biāo)準(zhǔn)：無臨床癥狀和體征，冠狀動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)心外膜下冠狀動(dòng)脈直徑狹窄超過50%［8?9］。（4）患者自愿行冠狀動(dòng)脈造影并同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）擴(kuò)張型心肌病、瓣膜性心臟病等器質(zhì)性心臟病。（2）有開胸手術(shù)（心臟手術(shù)）或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的既往史。（3）心電圖存在病理性Q波，ST段或T波缺血性改變以及左束支傳導(dǎo)阻滯等異常。（4）伴有嚴(yán)重肝、腦、腎、凝血功能障礙，免疫系統(tǒng)疾病，急慢性感染及心理障礙。（5）有局部麻藥過敏、特殊用藥史、藥物濫用的患者。最終共納入患者120 例，其中男75 例，女45 例，年齡55～70 歲，平均（62.33±4.86）歲，糖尿病病程1～20 年，平均（9.73±5.39）年。根據(jù)是否合并SMI 分為2型糖尿病未合并SMI的患者60例（D組）和2型糖尿病合并SMI的患者60例（DS組）。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本量計(jì)算 本研究樣本量采用公式n1=n2=2［（μα+μβ）/（δ/σ）］2+1/4μ2α進(jìn)行計(jì)算，n1和 n2分別為 D 組和 DS 組所需含量；δ=μ1?μ2，為兩總體均數(shù)之差值，σ為總體標(biāo)準(zhǔn)差（此處假設(shè)兩總體標(biāo)準(zhǔn)差相等）；μα和μβ分別為檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 和Ⅱ型錯(cuò)誤概率β相對(duì)應(yīng)的值。此處α取雙側(cè)，μα=μ0.05/2=1.96；β取單側(cè)，μβ=μ0.01=1.28。本研究未指定δ，因此對(duì)δ/σ進(jìn)行適當(dāng)假定，此處假定δ/σ=0.60，則本研究樣本量計(jì)算如下n1=n2=2［（1.96+1.28）/0.6］2+1/4×1.962=59.4≈60。

1.2.2 臨床資料收集 收集所有患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、糖尿病病程、心血管并發(fā)癥、糖尿病慢性并發(fā)癥（DPN、DN、DR）、用藥情況，包括降糖藥：雙胍類、磺脲類、糖苷酶抑制劑、格列奈類、胰島素及胰島素類似物、胰高血糖素樣肽（GLP）?1受體激動(dòng)劑、鈉?葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（SGLT）2抑制劑、二肽基肽酶Ⅳ（DDP4）抑制劑、中成藥，降壓藥，調(diào)脂藥。計(jì)算患者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)后由2名心血管內(nèi)科醫(yī)生共同對(duì)病變部位、范圍、嚴(yán)重程度做出明確診斷并收集結(jié)果，計(jì)算冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)Gensini積分［10］。

1.2.3 血清空腹血糖（FBG）、N/OFQ、Lp?PLA2水平檢測(cè) 于術(shù)前1 d 采集患者空腹非輸液側(cè)肘靜脈血4 mL，于含有STTⅡ分離膠促凝劑的靜脈真空采血管中分離血清并儲(chǔ)存在?70 ℃冰箱中待測(cè)。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定FBG。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清N/OFQ 水平（試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM?12706H1?96T）。經(jīng)乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)Lp?PLA2水平。

1.2.4 生化檢測(cè) 所有患者于入院第2天抽取空腹非輸液側(cè)肘靜脈血進(jìn)行生化檢測(cè)，并收集患者術(shù)前24 h尿液。采用高壓液相法測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。采用雙縮脲法檢測(cè)24 h尿蛋白定量。

1.2.5 血清N/OFQ 和Lp?PLA2 聯(lián)合預(yù)測(cè)因子構(gòu)建方法 以2 型糖尿病患者是否并發(fā)SMI 作為二分類結(jié)局變量，血清N/OFQ（x1）和血清Lp?PLA2（x2）預(yù)測(cè)指標(biāo)作為自變量，建立二元Logistic 回歸方程logi（tP）=β0+β1x1+β2x2，其中β0為常數(shù)項(xiàng)，β1與β2分別為血清N/OFQ（x1）與血清Lp?PLA2（x2）的偏回歸系數(shù)。對(duì)二元Logistic 回歸方程進(jìn)行等式變換，將x1的偏回歸系數(shù)設(shè)為1，可得到聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的表達(dá)式其中因?yàn)槭蔷€性方程在Y 軸上的截距，而去掉截距后，僅引起線性方程的平移，不會(huì)改變聯(lián)合預(yù)測(cè)因子對(duì)于預(yù)測(cè)2型糖尿病患者是否并發(fā)SMI的ROC曲線的構(gòu)建結(jié)果，故本研究中聯(lián)合預(yù)測(cè)因子的表達(dá)式可進(jìn)一步變化為其中x1、x2分別是指血清N/OFQ、Lp?PLA2水平與β2分別為x1與x2的偏回歸系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料之間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析。應(yīng)用Logistic回歸分析糖尿病合并SMI的影響因素，采用二元Logistic 回歸分析方法，構(gòu)建血清N/OFQ 與Lp?PLA2預(yù)測(cè)糖尿病發(fā)生SMI 的聯(lián)合預(yù)測(cè)因子。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，分析N/OFQ、Lp?PLA2 及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI發(fā)生的最佳臨界值、曲線下面積（AUC）和診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者一般資料比較 DS 組糖尿病病程、FBG、TG、LDL?C、血清N/OFQ、Lp?PLA2 水平高于D組，HDL?C 水平低于D 組（P＜0.01），2 組患者年齡、性別、身高、體質(zhì)量、BMI，合并高血壓、DPN、DN、DR比例，HbA1c、AST、ALT、Scr、BUN、24 h 尿蛋白定量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 2 組患者降糖藥、降壓藥、調(diào)脂藥使用情況 2組患者使用降糖藥、降壓藥、調(diào)脂藥情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。DS 組18 例（30%）患者使用1 種降糖藥，18例（30%）使用2種降糖藥，24例（40%）使用3種及以上降糖藥；D組15例（25%）患者使用1種降糖藥，30例（50%）患者使用2種降糖藥，15例（25%）患者使用3種及以上降糖藥，2組患者使用的降糖藥數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.069，P＞0.05）。

2.3 DS 組不同冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)Gensini 積分比較 DS 組冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果顯示，60 例患者平均Gensini 積分為（29.77±15.46）分，其中30例（50%）為單支病變，12例（20%）為雙支病變，18例（30%）為多支病變，Gensini 積分分別為（18.87±10.32）分、（33.00±9.31）分、（45.78±10.16）分，Gensini 積分隨著病變支數(shù)增多而升高（F=40.843，P＜0.01）。

Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients表1 2組患者一般資料比較

Tab.2 The use of hypoglycemic drugs,antihypertensive drugs and lipid-lowering drugs in two groups of patients表2 2組患者降糖藥、降壓藥、調(diào)脂藥使用情況 例（%）

2.4 糖尿病合并SMI影響因素 以是否合并SMI為因變量（是=1，否=0），以糖尿病病程、FBG、TG、LDL?C、N/OFQ、Lp?PLA2 為自變量，納入Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示 FBG、TG、LDL?C、血清 N/OFQ、Lp?PLA2 水平升高是糖尿病合并SMI 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表3。

2.5 DS組血清N/OFQ、Lp?PLA2水平與臨床各指標(biāo)的相關(guān)性分析 DS 組FBG、LDL?C、Gensini 積分與血清N/OFQ、Lp?PLA2水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。糖尿病病程、HbA1c與血清N/OFQ水平呈正相關(guān)，而與血清Lp?PLA2水平無顯著相關(guān)。血清N/OFQ與Lp?PLA2 水平呈正相關(guān)（P＜0.01）。年齡、身高、體質(zhì)量、BMI、AST、ALT、TG、HDL?C 與血清N/OFQ、Lp?PLA2水平無相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

Tab.3 Multiple Logistic analysis of risk factors of diabetes with SMI表3 糖尿病合并SMI影響因素的多因素Logistic分析

Tab.4 Analysis of the correlation between serum N/OFQ and Lp-PLA2 levels and clinical indicators in patients with diabetes and SMI表4 合并SMI患者的臨床各指標(biāo)于血清N/OFQ、Lp-PLA2水平的相關(guān)性分析

2.6 N/OFQ、Lp?PLA2 預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI 的ROC曲線分析 建立二元Logistic回歸方程的結(jié)果顯示，logit（P）=?10.511+1.481x1+0.013x2，聯(lián)合預(yù)測(cè)因子=x1+0.013/1.481x2，其中x1，x2分別為血清N/OFQ、Lp?PLA2 水平，見表 5。以 DS 組為陽(yáng)性樣本，以 D 組為陰性樣本，建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示，N/OFQ、Lp?PLA2預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI的AUC分別為0.949、0.899，兩者的聯(lián)合預(yù)測(cè)因子AUC 為0.956，見表6、圖1。

Tab.5 The results of binary Logistic regression analysis of N/OFQ and Lp-PLA2 combined to predict diabetes with SMI表5 N/OFQ與Lp-PLA2聯(lián)合預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI的二元Logistic回歸分析結(jié)果

Tab.6 The predictive values of serum N/OFQ,Lp-PLA2 and combined predictor for diabetes with SMI表6 血清N/OFQ、Lp-PLA2、聯(lián)合預(yù)測(cè)因子對(duì)糖尿病合并SMI的預(yù)測(cè)價(jià)值

Fig.1 The ROC curves of N/OFQ and Lp?PLA2 and combined predictor for predicting diabetes with SMI圖1 N/OFQ、Lp?PLA2及聯(lián)合預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI發(fā)生的ROC曲線

3 討論

截至2019年，全球20～99歲的成年人中有4.88億（9.5%）患有糖尿病，而過去10 年里，糖尿病的流行中心是中國(guó)、印度、美國(guó)、巴基斯坦和巴西［11］。2型糖尿病（T2DM）通常與多種心血管并發(fā)癥相關(guān)。研究表明，糖尿病患者冠狀動(dòng)脈斑塊的組成與非糖尿病患者不同，這可能是患有糖尿病的成年人心血管疾病，例如冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）、卒中和糖尿病性心肌病等的發(fā)病率和死亡率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)比無糖尿病的成年人大約高2.5～5 倍的原因之一，值得注意的是，因合并的心血管疾病死亡的患者占糖尿病患者死亡的65%［12］。SMI 是糖尿病患者中最常見的CAD，發(fā)展到一定程度可導(dǎo)致心肌梗死或心源性猝死，其機(jī)制與動(dòng)脈粥樣硬化，血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙有關(guān)，可能是高血糖導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)血管組織，觸發(fā)促炎癥和促纖維化信號(hào)，增加活性氧類（ROS）和晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）沉積，激活腎素?血管緊張素?醛固酮系統(tǒng)，進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的［13］。

SMI 是冠心病的一種，除極少數(shù)患者能捕捉到發(fā)作時(shí)的心電圖外，創(chuàng)傷性藥物激發(fā)試驗(yàn)仍是目前診斷SMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但國(guó)內(nèi)缺乏相應(yīng)藥物，臨床難以開展，因此國(guó)內(nèi)SMI仍主要依靠有創(chuàng)性檢查，即冠狀動(dòng)脈造影術(shù)確診［14］。Gensini 積分是基于冠狀動(dòng)脈形態(tài)、解剖和病變狹窄程度的國(guó)際公認(rèn)的評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變程度的良好指標(biāo)，與長(zhǎng)期和短期心血管風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，DS 組 Gensini 積分隨病變支數(shù)的增多而升高，與Zhao等［16］的研究結(jié)果一致，提示病變支數(shù)越多，冠狀動(dòng)脈病變程度越嚴(yán)重，而其缺乏明顯胸悶、胸痛等典型心絞痛癥狀可能與糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的內(nèi)源性阿片肽類物質(zhì)（內(nèi)啡肽）提高疼痛閾值或長(zhǎng)期血糖升高激活ROS損傷血管壁，導(dǎo)致血脂紊亂或感覺神經(jīng)末梢損害而引起自主神經(jīng)病變有關(guān)［7］。SMI 的發(fā)生與脂質(zhì)沉積有關(guān)，本研究結(jié)果顯示 DS 組 TG、LDL?C 水平高于 D組，HDL?C 水平低于 D 組，經(jīng)過 Logistic 回歸分析顯示，TG、LDL?C 升高是糖尿病合并SMI 發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其原因可能與組織型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI?1）活性增加有關(guān)［17］。

除TG、LDL?C 外，SMI 的發(fā)生還與其他因素有關(guān)，Logistic 回歸分析顯示FBG、N/OFQ、Lp?PLA2 升高均是糖尿病合并SMI發(fā)生的危險(xiǎn)因素。N/OFQ是一種新的內(nèi)源性阿片肽，已被證實(shí)參與疼痛的調(diào)節(jié)，并與炎癥反應(yīng)有關(guān)。已有研究表明N/OFQ可以通過抑制胰島素降解酶對(duì)胰島素的降解，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展［18］。由于降糖藥的治療主要機(jī)制是糾正胰島素抵抗和胰島素分泌受損，而2 組患者降糖藥使用情況并無顯著差異，因此認(rèn)為降糖藥的使用情況對(duì)2組血清N/OFQ的水平并無顯著影響。筆者前期研究［19］發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清N/OFQ 水平升高且可能與炎癥有關(guān)，也有研究［20］表明N/OFQ與炎癥所致的心房纖維化及房顫的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示N/OFQ 可能與炎癥所致的SMI 的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與D 組比較，DS 組血清N/OFQ 水平升高，提示 N/OFQ 與 SMI 有關(guān)，可能是SMI患者體內(nèi)存在更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

Lp?PLA2是近期發(fā)現(xiàn)的一種可以預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈病變程度的炎癥因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌，其可以與LDL?C、HDL?C結(jié)合，被運(yùn)送到動(dòng)脈壁上的易損區(qū)域，被水解氧化后吸引炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性趨化因子參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［4,21］。本研究結(jié)果顯示，與 D 組比較，DS 組血清Lp?PLA2 水平升高，且血清 N/OFQ 與 Lp?PLA2 水平呈正相關(guān)，兩者均與FBG、LDL?C 水平、Gensini 積分呈正相關(guān)，提示N/OFQ 可以通過炎癥反應(yīng)參與糖尿病合并SMI的發(fā)生，而N/OFQ、Lp?PLA2均可以通過調(diào)節(jié)血糖、LDL?C 參與SMI 的發(fā)生。其機(jī)制可能是長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致神經(jīng)末梢缺血缺氧，ROS釋放增多，刺激血管壁導(dǎo)致內(nèi)膜損傷。一方面，促炎因子腫瘤壞死因子（TNF）?α、白細(xì)胞介素（IL）?1β 等產(chǎn)生增加，而N/OFQ在TNF?α、IL?1β等的介導(dǎo)下通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF?κB）等通路使誘導(dǎo)表達(dá)增加，增多的N/OFQ 通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞使Lp?PLA2分泌增多，繼而Lp?PLA2與LDL?C結(jié)合，通過受損內(nèi)皮進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜后氧化修飾成氧化型LDL?C（ox LDL?C）并進(jìn)一步吸引炎性細(xì)胞［22］；另一方面，局部炎癥免疫細(xì)胞（包括多形核中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）活化，而N/OFQ在血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞表面具有高親和力結(jié)合位點(diǎn)，可以促進(jìn)單核細(xì)胞趨化并促進(jìn)脂質(zhì)斑塊形成，在兩者的共同作用下，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，脂質(zhì)斑塊形成［20］。

本研究DS組血清N/OFQ與糖尿病病程、HbA1c水平呈正相關(guān)，而Lp?PLA2 與兩者無顯著相關(guān)，提示N/OFQ 可能是比Lp?PLA2 更為有效的預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI的因子。進(jìn)一步繪制ROC曲線并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與Lp?PLA2相比，N/OFQ預(yù)測(cè)SMI的靈敏度和特異度更高，提示N/OFQ 可以成為預(yù)測(cè)糖尿病合并SMI的有效指標(biāo)。

綜上所述，糖尿病合并SMI 患者血清N/OFQ、Lp?PLA2 含量升高，降低糖尿病患者的炎癥反應(yīng)程度以及 N/OFQ、Lp?PLA2 水平對(duì)合并 SMI 的患者有利。本研究的不足之處為樣本量有限，可能存在結(jié)果偏倚，比如，本研究結(jié)果顯示年齡不是糖尿病患者SMI 發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而國(guó)內(nèi)外研究顯示年齡屬于不可改變的危險(xiǎn)因素，可能與研究選擇的患者年齡范圍比較窄或病程相對(duì)較短有關(guān)。此外，N/OFQ、Lp?PLA2參與糖尿病合并SMI發(fā)生的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。