山莨菪堿對(duì)橫紋肌溶解致急性腎損傷大鼠保護(hù)作用的研究

安麗平，王偉，楊洪霞，安然，于琨，吳廣禮，李云峰△

橫紋肌溶解（rhabdomyolysis，RM）易引發(fā)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），其發(fā)生率為15%～50%［1?3］，典型病理特征是腎小管損傷，尤其是腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。目前普遍認(rèn)為肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素［4?7］，但其致病的分子機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明，各種凋亡途徑，包括死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑均參與了腎小管上皮細(xì)胞凋亡［8］。

Gburek等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Mb通過(guò)與腎小管近端膜上低密度脂蛋白受體家族成員Megalin 和Cubilin 的結(jié)合，從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿內(nèi)，在溶酶體作用下降解為血紅素、自由基及氨基酸等小分子物質(zhì)。若大量Mb濾過(guò)腎小球進(jìn)入腎小管，除產(chǎn)生蛋白管型外，還會(huì)產(chǎn)生較多的自由基，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激等反應(yīng)，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，最終引起腎臟的損傷。另外，Terman 等［10］提出了溶酶體?線粒體軸理論（lysosomal?mitochondrial axis theory），即各種原因（如氧化應(yīng)激等）致使溶酶體膜通透性和完整性改變后，可引起溶酶體內(nèi)的水解酶［如溶酶體組織蛋白酶B（Cathepsin B）］釋放和溶酶體功能不全，進(jìn)而可能通過(guò)多種方式影響線粒體的功能，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。大量的Mb可能引發(fā) Megalin 或 Cubilin 的過(guò)度表達(dá)［11］。大量的 Mb 被運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解，可能引起溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome?associated membrane proteins，LAMPs）的改變，使得溶酶體水解酶釋放及溶酶體功能受損，激活腎小管上皮細(xì)胞凋亡途徑，進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)山莨菪堿可以明顯減輕橫紋肌溶解導(dǎo)致的急性腎損傷［12?13］，但其機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)建立甘油肌注導(dǎo)致的橫紋肌溶解致急性腎損傷大鼠模型，觀察山莨菪堿對(duì)腎小管上皮細(xì)胞及腎臟組織內(nèi)LAMP2 和Cathepsin B 表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)溫濕度及晝夜交替照明環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。鹽酸消旋山莨菪堿注射液（10 mg/支）購(gòu)自杭州民生藥業(yè)有限公司；大鼠Mb酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司；丙二醛（MDA，A003?1）、超氧化物歧化酶（SOD，A001?3）、肌酐（Scr，C011?2）、尿素氮（BUN，C013?2）和肌酸激酶（CK，A032）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RIPA 組織/細(xì)胞裂解液（P0013）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；LAMP2抗體（ab203224）、Cathepsin B 抗體（ab214428）購(gòu)自 Abcam 公司；Megalin 抗體（sc?515772）購(gòu)自 Santa Cruze 公司；β?actin 鼠單克隆抗體（CW0096，北京康維世紀(jì)）；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、PV法檢測(cè)試劑盒、DAB 試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL高敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。2?16KL型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；7170型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司；RM2245 型半輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica 公司；SpectraMax190 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司；EPS200蛋白電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 將63 只大鼠禁食、禁水24 h后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和給藥組，各21只。對(duì)照組不給予任何處理。模型組和給藥組采用甘油肌注法建立橫紋肌溶解致急性腎損傷大鼠模型。模型組大鼠后肢肌內(nèi)注射50%甘油（10 mL/kg）。給藥組首先腹腔注射山莨菪堿（1 mg/kg），20 min后肌內(nèi)注射50%甘油（10 mL/kg）。

1.2.2 標(biāo)本處理 分別在肌內(nèi)注射后0、6、12、24、48、72、120 h 時(shí)，各組隨機(jī)抽取3 只大鼠，取大鼠下腔靜脈血2 mL，靜置40 min，6 000 r/min 離心10 min，取血清于?20 ℃保存。取血后采用放血法處死大鼠。迅速摘取雙腎，剝離外層膜，將右腎置于液氮并于?80 ℃保存。左腎縱行剖開，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片（厚約5 μm），用于HE 染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 腎臟組織學(xué)檢測(cè) 切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟后行常規(guī)HE 染色，拍照（DP70 數(shù)碼相機(jī)，Olympus Optical Co，Ltd.，日本），然后用 Image?Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD，USA）軟件分析其損傷程度。腎臟組織學(xué)變化局限在腎小管間質(zhì)區(qū)域，分為不同的損傷等級(jí)［14?15］。Ⅰ級(jí)：腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性、壞死、脫屑的區(qū)域占皮質(zhì)小管的≤25%；Ⅱ級(jí)：變化涉及的皮質(zhì)小管區(qū)域?yàn)椋?5%～50%；Ⅲ級(jí)：變化涉及的皮質(zhì)小管區(qū)域?yàn)椋?0%～75%；Ⅳ級(jí)：變化涉及的皮質(zhì)小管區(qū)域＞75%。

1.2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用日立7170 型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清腎功能指標(biāo)。脲酶法測(cè)定血清BUN，肌氨酸氧化酶法測(cè)定血清Scr，比色法測(cè)定血清CK，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5 腎臟組織中MDA 和SOD 含量測(cè)定 硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA含量，WST?1法測(cè)定SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用SpectraMax190 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別在532 nm和450 nm處測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算MDA含量和SOD活性。

1.2.6 ELISA 法檢測(cè)血清Mb水平 配置倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、清洗緩沖液、TMB 顯色液、抗體混合物；向ELISA 測(cè)試孔中加入50 μL倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品，向所有孔中添加50 μL 抗體混合物，室溫孵育1 h；吸棄孔中的液體，用350 μL 1× Wash Buffer清洗；向每孔中加入100 μL TMB顯色液，室溫孵育10 min；加入100 μL終止液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品OD值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算Mb水平。

1.2.7 免疫組化法檢測(cè)腎組織中LAMP2、Cathepsin B、Megalin 的表達(dá) 腎臟組織切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，采用微波法對(duì)切片進(jìn)行10 min 抗原修復(fù)，室溫下用3%H2O2孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，然后用5%山羊血清封閉40 min，滴加一抗（LAMP2 抗體1∶50，Cathepsin B 抗體1∶50，Megalin 抗體1∶25）至組織切片上4 ℃過(guò)夜；PBS洗滌3次，滴加二抗［山羊抗兔二抗（PV6001），山羊抗小鼠二抗（PV6002）］，37 ℃孵育30 min。DAB 顯色劑顯色，在顯微鏡下監(jiān)測(cè)控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，切片經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織中蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×40）評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞比例和顯色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：＜5%計(jì)1 分、5%～25%計(jì)2 分、26%～50%計(jì)3 分、51%～75%計(jì)4 分；陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陰性計(jì)0分、弱陽(yáng)性計(jì)1分、陽(yáng)性計(jì)2分、強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)3分，通過(guò)將陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分（1～4分）和顯色強(qiáng)度評(píng)分（0～3分）相乘得出免疫組化評(píng)分（0～12分）。

1.2.8 Western blot 法檢測(cè)腎組織中 LAMP2、Cathepsin B 和Megalin的表達(dá) 取凍存腎組織，加入RIPA組織/細(xì)胞裂解液勻漿液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。樣本經(jīng)SDS?PAGE電泳分離，Megalin 蛋白使用 6.5% SDS?PAGE 凝膠，其他蛋白用 10%SDS?PAGE 凝膠，采用濕式電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Megalin小鼠單克隆抗體（1∶100）、LAMP2 兔多克隆抗體（1∶ 1 000）、Cathepsin B兔單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。用TBS?T 緩沖液洗滌之后與HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。ECL 高敏化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X 線膠片顯影。膠片掃描后采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。β?actin蛋白作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備后腎臟形態(tài)學(xué)的變化 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腎小管形態(tài)清晰，小管和上皮細(xì)胞界限清晰。模型組腎臟組織逐漸出現(xiàn)病理學(xué)變化，表現(xiàn)為腎損傷。甘油肌注24 h時(shí)腎臟組織學(xué)變化最為明顯，腎小管上皮細(xì)胞脫落、凋亡或壞死，有大量蛋白管型出現(xiàn)，剝脫的上皮細(xì)胞聚集在近曲小管和遠(yuǎn)曲小管（Ⅳ級(jí)）。48 h時(shí)，腎小囊的空間進(jìn)一步變大，上皮細(xì)胞碎片剝離脫落進(jìn)入腎小管腔（Ⅲ級(jí)）。72 h時(shí)，蛋白管型逐步溶解和消失，部分損傷區(qū)域的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)間歇性再生（Ⅱ級(jí)），見(jiàn)圖1。因甘油處理24 h 時(shí)腎臟組織學(xué)變化最為明顯，故對(duì)24 h時(shí)各組的腎臟外觀和組織形態(tài)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，對(duì)照組腎臟表現(xiàn)為深粉色，表面光滑，完好未受損傷；模型組腎臟呈棗紅色，由于受到損傷，表面有較多“白點(diǎn)”；與模型組相比，給藥組腎臟呈亮棕色，“白點(diǎn)”少（輕），且腎臟體積稍小，見(jiàn)圖2；HE染色結(jié)果顯示，給藥組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死和剝脫程度較模型組低，見(jiàn)圖3。

Fig.1 Representative morphological changes in kidney at different time points after glycerol treatment (HE staining,×400)圖1 甘油肌注后不同時(shí)間點(diǎn)腎組織形態(tài)學(xué)改變（HE染色，×400）

Fig.2 The effect of anisodamine on macroscopic changes in kidney at 24 h圖2 山莨菪堿給藥24 h對(duì)腎臟外觀形態(tài)的影響

Fig.3 The effect of anisodamine on morphological changes in kidney at 24 h(HE staining，×400)圖3 山莨菪堿給藥24 h對(duì)腎臟組織形態(tài)變化的影響（HE染色，×400）

Fig.5 The protein expression of Cathepsin B in cross sections of rat kidney in different treatment groups after intramuscular injection of glycerol for 24 hours(immunohistochemical staining，×400)圖5 各組大鼠腎臟橫斷面甘油肌注24 h Cathepsin B蛋白的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

Fig.6 The protein expression of Megalin in cross sections of rat kidney in different treatment groups after intramuscular injection of glycerol for 24 hours(immunohistochemical staining，×400)圖6 各組大鼠腎臟橫斷面甘油肌注24 h Megalin蛋白的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)、MDA、SOD和Mb的變化

2.2.1 Scr 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)血清Scr 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組和給藥組甘油處理后血清Scr水平升高，并高位維持在24～48 h，隨后逐步下降。組間比較：甘油處理前（0 h）3組間Scr水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘油處理后各時(shí)點(diǎn)模型組和給藥組Scr 水平均較對(duì)照組升高，其中24、48 h 時(shí)給藥組Scr水平低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2.2 BUN 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)BUN 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組血清BUN水平在甘油肌注后逐漸升高，24 h 達(dá)到最高值，隨后明顯下降；給藥組甘油肌注6 h 時(shí)BUN 水平升至最高，隨后逐漸下降。組間比較：甘油肌注前（0 h）3 組間BUN 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘油肌注后模型組各時(shí)點(diǎn)BUN水平均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；給藥組除48 h 外，其余時(shí)點(diǎn)BUN 水平亦較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；給藥組12、24 h 時(shí)BUN 水平顯著低于模型組（P＜0.05），其余時(shí)點(diǎn)與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.2.3 CK 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)CK 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組和給藥組甘油肌注6 h時(shí)血清CK水平顯著增高，達(dá)到峰值，12 h時(shí)CK水平較6 h顯著下降（P＜0.05），24～120 h時(shí)血清CK水平與0 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較：甘油肌注前（0 h）3組間CK水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘油肌注6～24 h 時(shí)模型組和給藥組CK 水平均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），48～120 h 時(shí)模型組和給藥組CK 水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘油肌注6 h時(shí)給藥組CK水平顯著低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.2.4 Mb 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)Mb 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組和給藥組在肌注甘油之后，Mb水平開始上升，24 h達(dá)到峰值，48～120 h逐漸下降，趨于平穩(wěn)。組間比較：甘油處理前（0 h）3組間Mb 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；甘油肌注6～48 h 時(shí)模型組和給藥組Mb 水平較對(duì)照組均明顯升高（P＜0.05），72、120 h 時(shí)模型組和給藥組Mb 水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥組甘油肌注24 h時(shí)血清Mb水平低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

Tab.1 Comparison of Scr levels between different treatment groups表1 3組不同時(shí)點(diǎn)血清Scr水平的比較 （n=3，μmol/L，）

Tab.1 Comparison of Scr levels between different treatment groups表1 3組不同時(shí)點(diǎn)血清Scr水平的比較 （n=3，μmol/L，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，D與24 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組給藥組F 0 h 12.85±2.73 12.87±2.79 12.76±2.69 0.121 6 h 12.54±2.33 21.28±4.58a 24.36±2.66aA 10.095＊12 h 12.13±2.67 27.33±4.51aA 24.33±2.11aA 18.274＊24 h 12.93±2.56 54.32±4.51aABC 28.48±2.37abA 121.193＊48 h 12.23±2.47 45.68±5.53aABC 30.40±4.06abA 47.426＊72 h 12.38±2.49 29.35±3.09aAD 26.52±2.75aA 33.913＊120 h 12.24±2.14 20.34±2.29a 24.25±2.84aA 19.390＊F 0.048 39.850＊11.892＊

Tab.2 Comparison of BUN levels between different treatment groups表2 3組不同時(shí)點(diǎn)血清BUN水平的比較 （n=3，mmol/L，）

Tab.2 Comparison of BUN levels between different treatment groups表2 3組不同時(shí)點(diǎn)血清BUN水平的比較 （n=3，mmol/L，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，D與24 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組給藥組F 0 h 5.67±1.12 5.61±1.21 5.62±1.85 0.002 6 h 5.48±0.97 8.56±0.21a 10.19±1.80aA 12.150＊12 h 5.26±0.96 15.54±1.69aAB 9.85±0.58abA 58.105＊24 h 5.54±1.21 25.02±1.76aABC 9.27±1.39abA 148.046＊48 h 5.47±1.24 9.34±1.78aACD 7.21±1.15B 5.642＊72 h 5.43±0.83 7.85±0.53aCD 7.55±0.57a 12.037＊120 h 5.31±0.82 6.79±0.60aCD 7.10±0.61aB 5.838＊F 0.052 87.740＊6.682＊

Tab.3 Comparison of serum CK levels between different treatment groups表3 3組不同時(shí)點(diǎn)血清CK水平的比較 （n=3，U/L，）

Tab.3 Comparison of serum CK levels between different treatment groups表3 3組不同時(shí)點(diǎn)血清CK水平的比較 （n=3，U/L，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組給藥組F 0 h 416.17±20.77 416.50±30.68 422.17±32.42 0.159 6 h 417.50±23.79 19 111.67±3 601.69aA 8 687.17±851.11abA 169.147＊12 h 412.00±31.31 1 879.00±258.94aB 2 119.33±360.03aAB 99.792＊24 h 417.67±31.51 479.33±29.28aB 465.03±55.33aBC 6.065＊48 h 417.00±25.87 400.83±33.39B 387.08±34.15BC 1.596 72 h 403.67±25.67 375.00±21.84B 373.33±33.55BC 2.610 120 h 407.33±30.12 372.33±25.33B 375.25±32.89BC 3.327 F 0.253 224.372＊348.265＊

Tab.4 Comparison of serum Mb levels between different treatment groups表4 3組不同時(shí)點(diǎn)血清Mb水平的比較 （n=3，ng/L，）

Tab.4 Comparison of serum Mb levels between different treatment groups表4 3組不同時(shí)點(diǎn)血清Mb水平的比較 （n=3，ng/L，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，D與24 h比較，E與48 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組給藥組F 0 h 205.16±8.04 204.39±8.56 205.31±10.24 0.009 6 h 204.97±12.84 297.31±26.16aA 278.47±25.93a 15.175＊12 h 205.02±12.27 353.50±23.11aAB 338.53±26.16aAB 46.750＊24 h 205.68±13.17 401.46±26.35aAB 355.89±19.07abAB 87.844＊48 h 204.67±14.33 381.02±23.56aABD 351.25±21.39aAB 74.440＊72 h 206.02±8.68 255.48±27.00CDE 234.49±23.74CDE 4.054 120 h 204.68±10.00 219.89±21.29CDE 210.44±21.28CDE 0.487 F 0.006 35.249＊28.035＊

2.2.5 MDA 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)MDA含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組和給藥組在肌注甘油6 h時(shí)組織中MDA含量上升，12 h達(dá)到峰值，24～72 h逐漸下降，趨于平穩(wěn)。組間比較：甘油肌注前（0 h）3組間MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘油肌注后各時(shí)點(diǎn)模型組和給藥組MDA含量均較對(duì)照組顯著升高；6、12 h 時(shí)給藥組 MDA 含量顯著低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

2.2.6 SOD 組內(nèi)比較：對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)腎臟組織勻漿中SOD活性無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組甘油肌注6、12 h 時(shí)腎臟組織SOD 活性較0 h 顯著降低（P＜0.05），24 h后逐步升高；給藥組肌注甘油6、12 h時(shí)SOD 活性較0 h 顯著降低（P＜0.05），24、48、72 h時(shí)SOD活性和0 h時(shí)無(wú)明顯差異。組間比較：甘油肌注前（0 h）3組間腎臟組織SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，模型組甘油肌注6～48 h 時(shí)SOD活性降低，給藥組甘油肌注6～24 h 時(shí)SOD 活性降低；與模型組比較，給藥組甘油肌注6、12 h時(shí)SOD活性顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表6。

2.3 各組大鼠 LAMP2、Cathepsin B、Megalin 的變化 免疫組化結(jié)果顯示，甘油肌注誘導(dǎo)急性腎損傷24 h 后，LAMP2 的陽(yáng)性信號(hào)主要位于凋亡壞死的近曲小管上皮細(xì)胞受損的頂膜，并伴有脫屑和壞死（圖4）；Cathepsin B 的陽(yáng)性信號(hào)主要位于凋亡壞死的近曲小管上皮細(xì)胞受損的頂膜（圖5）。Megalin的陽(yáng)性信號(hào)主要位于凋亡壞死的近曲小管上皮細(xì)胞受損的頂膜（圖6）。甘油處理24 h后，LAMP2、Cathepsin B、Megalin 蛋白表達(dá)水平明顯升高；而山莨菪堿給藥后，LAMP2、Cathepsin B、Megalin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7。Western blot 結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，見(jiàn)圖8。

Fig.7 The expressions of LAMP2,Cathepsin B and Megalin proteins in different treatment groups after intramuscular injection of glycerol for 24 hours detected by immunohistochemical staining圖7 免疫組化法檢測(cè)甘油肌注24 h各組LAMP2、Cathepsin B、Megalin蛋白的表達(dá)

3 討論

橫紋肌溶解易引發(fā)急性腎損傷，急性腎損傷作為臨床常見(jiàn)急危重癥，致病因素眾多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。本研究HE 染色結(jié)果顯示模型組在甘油肌注后發(fā)生了明顯的腎損傷，腎功能指標(biāo)Scr、BUN及CK水平較對(duì)照組明顯升高；而山莨菪堿給藥后腎小管損傷程度明顯降低，甘油肌注24 h 和48 h 的血清Scr、12 h 和 24 h 的血清 BUN 及 6 h 時(shí)的血清 CK 水平均低于模型組。以上結(jié)果表明山莨菪堿給藥處理能明顯改善腎臟損傷情況。

Tab.5 Comparison of MDA content in kidney tissues between different treatment groups表5 3組不同時(shí)點(diǎn)腎臟組織MDA含量的比較 （n=3，mmol/mg，）

Tab.5 Comparison of MDA content in kidney tissues between different treatment groups表5 3組不同時(shí)點(diǎn)腎臟組織MDA含量的比較 （n=3，mmol/mg，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，D與24 h比較，P＜0.05

組別0 h6 h12 h24 h48 h72 hF對(duì)照組模型組給藥組F 2.41±0.27 2.34±0.21 2.37±0.24 0.059 2.32±0.26 34.69±4.88aA 24.18±3.95abA 62.164＊2.35±0.38 42.56±3.16aAB 30.50±3.01abAB 154.543＊2.36±0.27 21.77±4.30aABC 16.34±2.27aABC 38.034＊2.31±0.37 17.70±3.57aABC 15.72±2.82aABC 30.255＊2.37±0.40 15.97±4.23aABCD 14.33±2.35aABC 21.052＊0.036 44.370＊37.972＊

Tab.6 Comparison of SOD activity in kidney between different treatment groups表6 3組腎臟組織SOD活性的比較（n=3，U/mg，）

Tab.6 Comparison of SOD activity in kidney between different treatment groups表6 3組腎臟組織SOD活性的比較（n=3，U/mg，）

＊P＜0.05；組間比較：a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 h比較，B與6 h比較，C與12 h比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組給藥組F 0 h 672.89±23.32 663.27±20.83 672.65±25.77 0.036 6 h 678.73±23.50 486.57±28.42aA 567.67±30.14abA 36.750＊12 h 678.86±25.63 450.80±17.34aA 579.63±29.28abA 64.845＊24 h 681.37±18.62 579.11±21.10aABC 606.72±30.22a 14.492＊48 h 670.44±17.89 594.80±18.13aABC 635.04±30.24 5.847＊72 h 676.33±16.26 620.47±14.51BC 655.26±32.04BC 3.819 F 0.113 38.376＊5.979＊

Fig.8 The expressions of LAMP2,Cathepsin B and Megalin proteins in different treatment groups after intramuscular injection of glycerol for 24 hours detected by Western blot assay圖8 Western blot檢測(cè)甘油肌注24 h各組LAMP2、Cathepsin B、Megalin蛋白的表達(dá)

氧化應(yīng)激和抗氧化之間的平衡在腎臟生理功能中起重要作用［14］。MDA 含量和 SOD 活性可作為判斷氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生自由基狀態(tài)的最基本的指標(biāo)［16］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組MDA含量顯著增高，SOD活性下降，間接表明Mb導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了急性腎損傷的形成；而山莨菪堿給藥后，與模型組比較，給藥組MDA 含量降低，SOD活性升高，提示山莨菪堿可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激改善急性腎損傷。

目前研究普遍認(rèn)為由Mb 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡或壞死是導(dǎo)致急性腎損傷的關(guān)鍵因素［4?7］。Mb 是分子質(zhì)量為17 800 Da 的球形蛋白，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)后，通過(guò)特異性受體Megalin 和Cubilin 的內(nèi)吞作用進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞并被代謝［9］。有研究表明腎小管內(nèi)Mb水平升高，一方面可形成管型阻塞腎小管，導(dǎo)致管腔內(nèi)壓力升高，腎小球?yàn)V過(guò)受阻，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞造成損傷［17］；另一方面Mb在酸性條件下分解產(chǎn)生亞鐵血紅素和珠蛋白，具有毒性，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷腎小管上皮細(xì)胞［7］。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組和給藥組在肌注甘油24 h 后Mb 水平上升至峰值，且Megalin蛋白表達(dá)水平明顯升高，與以往研究結(jié)果一致；而山莨菪堿給藥后，給藥組Mb 水平較模型組明顯降低，且Megalin 蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示過(guò)量的Mb 濾過(guò)腎小球后，可能激發(fā)了Megalin 的迅速合成以應(yīng)對(duì)Mb水平的升高，山莨菪堿可能通過(guò)下調(diào)Megalin的表達(dá)改善急性腎損傷。

有研究表明，生物合成所需的鐵主要來(lái)自鐵蛋白的自噬。溶酶體通過(guò)自噬降解鐵蛋白將鐵釋放入細(xì)胞質(zhì)，在溶酶體的酸性環(huán)境中促使Fe3+被轉(zhuǎn)化成Fe2+［18?20］，而 Fe2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)參與合成代謝之前，溶酶體是其存在的最主要場(chǎng)所［21?22］。過(guò)量的鐵如果沉積在溶酶體內(nèi)，可引發(fā)溶酶體功能特性改變，表現(xiàn)為溶酶體密度增加、膜易破裂等。這種改變與鐵聚集的程度及其持續(xù)時(shí)間有關(guān)［23］。因此，本研究關(guān)注了溶酶體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。LAMP2 是維持溶酶體膜完整性的重要蛋白之一，參與多種物質(zhì)的運(yùn)輸。Cathepsin B 是一種重要的蛋白水解酶，其不僅可在溶酶體內(nèi)降解蛋白質(zhì)，還可分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，模型組LAMP2和Cathepsin B蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和給藥組，提示急性腎損傷中溶酶體功能可能受損，而山莨菪堿可能通過(guò)下調(diào)LAMP2 和Cathepsin B 的表達(dá)來(lái)改善甘油肌注導(dǎo)致的腎損傷。這與以往研究顯示老年大鼠急性腎損傷可引起LAMP2表達(dá)水平升高的結(jié)果一致［24］。

綜上所述，山莨菪堿可能通過(guò)下調(diào)近曲小管上皮細(xì)胞膜上Megalin受體的表達(dá)，下調(diào)溶酶體相關(guān)蛋白LAMP2和Cathepsin B的表達(dá)，進(jìn)而影響溶酶體的功能來(lái)發(fā)揮改善急性腎損傷的作用。由此表明，山莨菪堿作為天然藥物能夠改善大鼠橫紋肌溶解所導(dǎo)致的急性腎損傷。