葡萄糖?6?磷酸脫氫酶抑制劑對(duì)小鼠氣道Club細(xì)胞增殖的影響

耿蓓，李寬，2，吳琦，李雙艷 ，陳懷永 ，2，4

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，主要特征之一為氣道上皮黏膜的損傷和重塑。研究氣道上皮黏膜損傷后的修復(fù)對(duì)維持以哮喘為代表的氣道炎癥性疾病的肺穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。氣道上皮黏膜由多種細(xì)胞群組成，豐度較高的細(xì)胞群為Club細(xì)胞（又稱Clara 細(xì)胞）。Clara 細(xì)胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein，CCSP）是Club 細(xì)胞特異性表達(dá)的標(biāo)志物［1］。包括Club細(xì)胞在內(nèi)的氣道上皮祖細(xì)胞的增殖功能是維持氣道上皮完整性和損傷后上皮黏膜修復(fù)的重要因素［2］，但其相關(guān)研究較少。近年來(lái)體外類器官模型逐漸成為研究干（祖）細(xì)胞功能的重要手段，本課題組前期通過(guò)建立氣道Club細(xì)胞3D類器官模型，觀察Club細(xì)胞在體外培養(yǎng)形成類器官的直徑和形成數(shù)量來(lái)判定其增殖功能［3］。筆者之前的研究表明，在雞卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，葡萄糖代謝對(duì)氣道Club細(xì)胞的增殖功能起重要調(diào)控作用，阻斷糖酵解途徑可抑制Club細(xì)胞的增殖，不利于氣道上皮損傷后炎癥的消退［4］。磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是機(jī)體除糖酵解途徑外的另一種葡萄糖代謝途徑。在OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘中磷酸戊糖途徑是否也參與了對(duì)Club細(xì)胞增殖的調(diào)控，從而影響哮喘氣道炎性損傷的修復(fù)進(jìn)程尚不清楚。本研究采用3D類器官培養(yǎng)模型，觀察磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）抑制劑6?氨基煙酰胺（6?AN）對(duì)Club細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠26 只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SYXK（津）2016?0002］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和管理過(guò)程均遵守天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠肺成纖維細(xì)胞系（MLg）購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)。哮喘造模采用自主研發(fā)制作的霧化倉(cāng)（專利號(hào)：CN 208910567 U），熒光定量 PCR（qPCR）儀（Light Cycler 96，Roche），酶標(biāo)儀（Multiskan Go，Thermo），倒置顯微鏡（Olympus 公司），F(xiàn)ACS Aria Ш 分選儀（BD Biosciences）。6?AN、OVA、氫氧化鋁佐劑和DNase I 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。山羊源一抗抗體（CCSP）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 生物科技有限公司，兔源一抗抗體（Ki67）購(gòu)自Cell signaling Technology 公司，驢源抗山羊二抗（Alexa Fluor?594 Donkey Anti?Goat IgG）和驢源抗兔二抗（Alexa Fluor?488 Donkey Anti?Rabbit IgG）均 購(gòu)自 Invitrogen 公 司 。 流 式抗體 anti?CD24?phycoerythrin（PE）、anti?EpCAM?PE?Cyanine7、Sca?1?allophycocyanin（APC）、anti?CD31?biotin、anti?CD34?biotin、anti?CD45?biotin、APC?eFluor 780、7?amino?actinomycin D（7AAD）均購(gòu)自 eBioscience 公司，Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自 BD Pharmingen 公司，24?well Transwell 小室購(gòu)自 Corning 公司。TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen 公司，SYBR Green PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Roche公司。

1.3 小鼠哮喘模型的建立 將12只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分成哮喘組和對(duì)照組。OVA 溶液由PBS 54.6 μL，氫氧化鋁44.4 μL，OVA儲(chǔ)液（10 g/L）1 μL配制而成。哮喘組在第0、7 天腹腔內(nèi)注射 OVA 溶液 100 μL 致敏。在第 14～18 天，用2%OVA溶液連續(xù)激發(fā)霧化5 d，0.5 h/次，1次/d。對(duì)照組用PBS 替代OVA 溶液，其他條件均相同。在第19 天時(shí)用7.5%水合氯醛麻醉小鼠，取肺組織。

1.4 三色染色法統(tǒng)計(jì)支氣管灌洗液（BALF）中的細(xì)胞類型和數(shù)量 收集上述哮喘造模后的BALF，1 000 r/min離心15 min后量取上清液的體積，細(xì)胞沉淀加PBS混勻，取10 μL加臺(tái)盼藍(lán)溶液按比例（1∶5）稀釋后用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。剩余細(xì)胞懸液涂片晾干后用Hema 3 染色劑進(jìn)行染色，染色順序如下：固定液（固定），染液Ⅰ（染核），染液Ⅱ（染質(zhì)）。乙醇脫色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)、形態(tài)、胞核胞質(zhì)的顏色，統(tǒng)計(jì)各種類型細(xì)胞數(shù)。

1.5 免疫熒光染色法檢測(cè)氣道Club細(xì)胞增殖 用10%福爾馬林溶液固定哮喘造模后獲取的肺組織，2 h后脫水、石蠟包埋和切片（5 μm）。切片脫蠟后在煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液中修復(fù)2 min，自然冷卻至室溫后加一抗（Ki67和CCSP，抗體和5%BSA溶液按1∶200稀釋）于4 ℃孵育過(guò)夜；PBS泡洗后加二抗（驢源抗山羊二抗和驢源抗兔二抗，抗體用5%BSA按1∶200 稀釋）于室溫孵育1.5 h；PBS 泡洗后用DAPI 熒光封片劑避光封片20 min。熒光顯微鏡對(duì)切片上含有氣道的全部視野拍照（高倍鏡：×200）。統(tǒng)計(jì)小鼠氣道中Ki67+CCSP+細(xì)胞占CCSP+細(xì)胞的比例。

1.6 小鼠氣道Club細(xì)胞分離與鑒定 用7.5%水合氯醛溶液麻醉小鼠后，經(jīng)氣管插管注入彈性蛋白酶（4 U/mL，3 mL/只）消化肺組織；切碎肺組織，加入Dnase I 獲得單細(xì)胞懸液。600×g離心5 min后用預(yù)冷的漢克平衡鹽溶液（HBSS）重懸細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記的抗體CD24、EpCAM、Sca?1、CD31、CD34和CD45冰上孵育45 min；HBSS終止反應(yīng)，加二抗（1∶100）于冰上孵育40 min；HBSS 終止反應(yīng)，流式細(xì)胞儀分選CD31?CD34?CD45?EpCAM+CD24+Sca?1+Club 細(xì)胞，分選策略見(jiàn)圖1。

1.7 qPCR 法測(cè)定Club 細(xì)胞中 glucose?6?phosphate dehydro?genase X?linked（G6pdx）mRNA表達(dá)情況 按照1.3的方法重新建立12只小鼠模型（對(duì)照組6只，哮喘組6只）。第19天按1.6方法分選Club細(xì)胞，TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA。取200 ng總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)目的基因mRNA 的表達(dá)。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)45次。分析 熔 解 曲 線 。G6pdx引 物 序 列 上 游 5'?CCACTC?CAGAAGAAAG ACCTAAG?3'，下游 5'?TGGCTGTTGAGGT?GCTTATAG?3'，內(nèi)參基因β-actin引物序列上游 5'?GGC?CAACCGTGAAAAGATGA?3'；下 游 5'?CAGCCTGGATGGC?TACGTACA?3'。待測(cè)樣本特定基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法為2?ΔCt，樣本特定基因ΔCt=該基因循環(huán)閾值（Ct）?內(nèi)參基因（β?actin）Ct值。

Fig.1 Sorting strategy of mouse airway Club cells圖1 小鼠氣道Club細(xì)胞分選策略

1.8 類器官培養(yǎng)法研究6?AN 對(duì)Club 細(xì)胞克隆形成的影響 按照1.6 分選Club 細(xì)胞的方法分選2 只C57BL/6 小鼠的Club細(xì)胞。將分選出來(lái)的Club細(xì)胞和MLg細(xì)胞混合，離心棄上清后加DMEM/F12（每個(gè)小室按50 μL 計(jì)算）重懸細(xì)胞，用涼槍頭加入等比例的Matrigel 基質(zhì)膠，吹打混勻后接種到Transwell 小室中（每個(gè)小室接種3 000 個(gè)Club 細(xì)胞，2×105個(gè)MLg 細(xì)胞），構(gòu)成3D 體外Club 細(xì)胞類器官培養(yǎng)模型。設(shè)0和10 μmol/L 6?AN兩組，每組5個(gè)復(fù)孔。接種后，在小室下面加410 μL 含0.1%Y27632 的干細(xì)胞培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h 后吸干凈，分別加入含有0、10 μmol/L 6?AN的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每隔48 h 換液1 次。培養(yǎng)至第8天時(shí)用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，測(cè)量并統(tǒng)計(jì)形成球狀結(jié)構(gòu)的平均直徑和克隆形成數(shù)量（選取直徑大于50 μm的球狀結(jié)構(gòu)計(jì)數(shù)）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘小鼠動(dòng)物模型的建立 與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮和食欲減退等癥狀。抽取BALF后肉眼觀察，哮喘組的BALF明顯較對(duì)照組渾濁。BALF三色染色涂片的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，哮喘組BALF 中的總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the 2 groups表1 2組BALF中不同種類細(xì)胞數(shù)比較（n=6，×105個(gè)，）

Tab.1 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the 2 groups表1 2組BALF中不同種類細(xì)胞數(shù)比較（n=6，×105個(gè)，）

＊P＜0.01

組別對(duì)照組哮喘組t總細(xì)胞1.11±0.72 12.99±3.04 9.307＊巨噬細(xì)胞0.73±0.68 0.82±0.50 0.258嗜酸性粒細(xì)胞0.02±0.02 9.70±2.64 8.977＊中性粒細(xì)胞0.20±0.16 2.08±0.94 4.831＊淋巴細(xì)胞0.15±0.15 0.39±0.30 1.747

2.2 OVA 誘導(dǎo)的哮喘對(duì)氣道Club 細(xì)胞增殖的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示哮喘組氣道中表達(dá)Ki67+CCSP+/CCSP+比例顯著高于對(duì)照組［11.43%（6.25%，17.57%）vs. 3.66%（2.50%，5.28%），n=6，Z=5.784，P＜0.01］，見(jiàn)圖2。

2.3 OVA 誘導(dǎo)小鼠哮喘Club 細(xì)胞中G6pdxmRNA的表達(dá)情況 哮喘組Club細(xì)胞G6pdxmRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（0.008±0.002vs.0.005±0.001，n=6，t=3.353，P＜0.01）。

2.4 6?AN 對(duì)氣道Club 細(xì)胞克隆形成的影響 3D類器官培養(yǎng)結(jié)果顯示，Club 細(xì)胞克隆形態(tài)為中空的球體結(jié)構(gòu)，10 μmol/L 6?AN 組Club 細(xì)胞的克隆直徑為（97.65±4.07）μm，顯著低于 0 μmol/L 6?AN 組的（208.01±10.28）μm（n=5，t=22.323，P＜0.01）；10 μmol/L 6?AN 組和 0 μmol/L 6?AN 組克隆形成數(shù)量分別為（150±12）個(gè)和（331±26）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，t=13.555，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

3 討論

Fig.2 The expression of CCSP and Ki67 in mouse lungs during OVA?induced asthma(immunofluorescence,×200)圖2 OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺中CCSP和Ki67的表達(dá)（免疫熒光，×200）

Fig.3 The effect of 6?AN on the proliferation of Club cells圖3 6?AN對(duì)Club細(xì)胞增殖的影響

哮喘作為一種慢性氣道炎癥性疾病，人群患病率和死亡率高，已經(jīng)成為一種危害人類健康的全球性疾?。?］。哮喘患者氣道上皮損傷，氣道炎癥持續(xù)存在。有研究表明氣道上皮損傷修復(fù)受阻是炎癥持續(xù)存在的本質(zhì)原因［6?7］。本研究利用 OVA 致敏后霧化小鼠，反復(fù)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，造模后的小鼠BALF 中總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量增高，與既往研究結(jié)果一致［8?10］，證明本研究中 OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型具有穩(wěn)定性。氣道干（祖）細(xì)胞增殖可補(bǔ)充哮喘氣道上皮損傷后減少的細(xì)胞池，促進(jìn)損傷的修復(fù)。近年來(lái)，對(duì)肺臟干細(xì)胞研究的增多和相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟為從提高氣道干（祖）細(xì)胞的增殖能力角度來(lái)治療哮喘提供了新思路。Club細(xì)胞是氣道上皮的重要祖細(xì)胞，能夠增殖并分化成纖毛細(xì)胞，在受到不利因素刺激后可分化成Goblet細(xì)胞［11?12］。氣道上皮損傷后是否能夠有效修復(fù)，與Club細(xì)胞的增殖功能密切相關(guān)。葡萄糖作為細(xì)胞代謝的主要能源物質(zhì)，主要通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut1）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)后被己糖激酶（HK）磷酸化，生成葡萄糖?6?磷酸（G6P）。G6P具有糖酵解或磷酸戊糖兩個(gè)代謝途徑，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖發(fā)揮重要調(diào)控作用［13］。在OVA 誘導(dǎo)的小鼠模型中，氣道炎癥細(xì)胞顯著增多，OVA 霧化停止后，小鼠可逐漸恢復(fù)到正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA 造模后的小鼠氣道中，Ki67+CCSP+Club 細(xì)胞增加，Club 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，這可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)性機(jī)制，機(jī)體通過(guò)Club 細(xì)胞的增殖以修復(fù)哮喘所造成的氣道損傷，加速清除炎性細(xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)氣道環(huán)境的穩(wěn)定性。有研究表明，哮喘后糖酵解途徑增強(qiáng)［14］。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的糖酵解途徑抑制劑2?脫氧?D?葡萄糖（2?DG）抑制Club 的增殖［4］，與本研究一致，證明哮喘后Club 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。G6PD 是磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶，本研究中，在OVA 誘導(dǎo)小鼠哮喘后G6pdx在Club 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明哮喘小鼠中磷酸戊糖途徑增強(qiáng)。6?AN 是G6PD 的特異性抑制劑。本研究利用Club類器官體外培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，6?AN 能減小Club 細(xì)胞形成類器官的直徑，降低Club 細(xì)胞類器官形成數(shù)量，說(shuō)明阻斷磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶G6PD能抑制Club細(xì)胞的增殖。筆者之前的研究表明，博來(lái)霉素造成的肺纖維化小鼠中，抑制糖酵解或磷酸戊糖途徑均能抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AT2）的增殖能力，干擾這兩條途徑也不利于博來(lái)霉素造成的肺泡上皮損傷后的修復(fù)［15］。這些研究提示，抑制G6PD 的活性不利于氣道和肺泡上皮損傷后的修復(fù)。

磷酸戊糖途徑可為機(jī)體提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和核糖?5?磷酸，最終用于核酸的合成。細(xì)胞的抗氧化過(guò)程離不開(kāi)谷胱甘肽（GSH）、NADPH途徑和谷胱甘肽還原酶的動(dòng)態(tài)平衡［16］。哮喘患者的呼出氣中 NO 水平顯著增高［17］，G6PD 的增加很可能是機(jī)體為抵御NO氧化而發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)。

氣道上皮的完整性對(duì)維持氣道上皮的穩(wěn)態(tài)極為重要。氣道損傷后是否能成功修復(fù)取決于氣道干（祖）細(xì)胞的增殖和分化能力的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。本研究著重于氣道祖細(xì)胞Club 細(xì)胞增殖能力的研究，6?AN對(duì)Club 細(xì)胞分化功能的影響需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究存在的局限性：類器官模型是基于離體組織干（祖）細(xì)胞的功能調(diào)控，在哮喘小鼠模型中，體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，Club細(xì)胞增殖與分化命運(yùn)受多種因素調(diào)控，可能與類器官模型研究結(jié)果不一致。葡萄糖代謝對(duì)Club 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制仍需要深入研究。綜上，本研究提示葡萄糖向磷酸戊糖途徑代謝對(duì)氣道Club 細(xì)胞增殖功能具有促進(jìn)作用，從再生醫(yī)學(xué)角度揭示了哮喘與氣道Club細(xì)胞之間的關(guān)系，為探索以Club細(xì)胞為靶向的抗哮喘治療提供了新思路。