大黃素聯(lián)合甲磺酸阿帕替尼通過(guò)上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的研究Δ

王 婧，馬 曉，尚 昆，林海珊，曹邦偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京 100050)

胰腺癌是惡性度較高的惡性腫瘤之一，2018年全球范圍內(nèi)報(bào)告了458 918例胰腺癌新病例，預(yù)計(jì)至2040年將出現(xiàn)355 317例新病例[1]。盡管在胰腺癌的檢測(cè)和治療方面取得了進(jìn)展，但患者5年生存率仍然只有9%。甲磺酸阿帕替尼是我國(guó)獨(dú)立研發(fā)的抑制腫瘤新生血管形成的靶向治療藥物，其不僅具有抑制腫瘤新生血管形成的作用，還有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[2]。本研究擬通過(guò)觀察大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及上述2種藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)所用大黃素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；甲磺酸阿帕替尼購(gòu)自江蘇恒瑞公司；胎牛血清購(gòu)自ExCell公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。

1.3 儀器

XD-101型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；IX51型生物倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；WH-2型振蕩器(上海滬西分析儀器廠)；UV-2450型紫外光度儀(日本SHIMADZU公司)；ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

2 方法

2.1 分組

本研究共分為對(duì)照組、甲磺酸阿帕替尼組、大黃素組及聯(lián)合用藥組(大黃素+甲磺酸阿帕替尼)。實(shí)驗(yàn)藥物按照特定濃度分別溶于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，對(duì)照組為不含藥物的培養(yǎng)基。

2.2 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力

將胰腺癌PANC-1細(xì)胞鋪于96孔板內(nèi)，每孔注入細(xì)胞懸液50 μl(約含1×104個(gè)細(xì)胞)，加入1640培養(yǎng)液50 μl。待細(xì)胞充分貼壁后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。作用72 h后，每孔加入MTT 20 μl，37 ℃孵育4 h后吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜 150 μl震蕩約10 min，測(cè)量波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率[3]。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法測(cè)定白細(xì)胞介素6(IL-6)、血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]的表達(dá)

分別收集四組細(xì)胞的上清液進(jìn)行檢測(cè)，選取美國(guó)Rapid Bio公司ELISA試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-6、Ang(1-7)水平[4]。

2.4 Western blot法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)、Mas受體蛋白表達(dá)水平

將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按照不同干預(yù)組給藥處理，置于37 ℃溫箱孵育24 h。按照經(jīng)典Western blot檢測(cè)方法，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，每樣品上樣30 g，進(jìn)行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后順序加ACE2、Mas、GAPDH一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，檢測(cè)雜交信號(hào)，計(jì)算蛋白含量[5]。

2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定ACE2、Mas受體蛋白表達(dá)情況

將胰腺癌細(xì)胞接種至6孔板中，待其生長(zhǎng)融合度達(dá)85%時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，觀察ACE2、Mas受體蛋白表達(dá)情況，用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝取熒光圖像[5]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布者通過(guò)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)；各測(cè)定值結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響

分別用不同濃度的大黃素(12.5、25、50、100及200 μmol/L)對(duì)PANC-1細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)結(jié)果顯示，大黃素及甲磺酸阿帕替尼單藥刺激PANC-1細(xì)胞，其抑制增殖能力均呈現(xiàn)劑量依賴性，見(jiàn)圖1。根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)，選擇大黃素實(shí)驗(yàn)濃度為100 μmol/L，甲磺酸阿帕替尼實(shí)驗(yàn)濃度為40 μmol/L。加藥干預(yù)細(xì)胞后，大黃素組細(xì)胞抑制率為11.72%，甲磺酸阿帕替尼組的抑制率為15.94%，聯(lián)合用藥組的抑制率為28.84%，聯(lián)合用藥組顯著高于單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A.大黃素；B.甲磺酸阿帕替尼A.emodin；B.apatinib mesylate圖1 不同濃度大黃素、甲磺酸阿帕替尼對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 1 Inhibition proliferation effect of emodin combined with apatinib mesylate on PANC-1 cell at different concentrations

圖2 不同藥物干預(yù)對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 2 Inhibition proliferation effect of different drug interventions on PANC-1 cell

3.2 大黃素、甲磺酸阿帕替尼以及聯(lián)合用藥組細(xì)胞上清液中IL-6、Ang(1-7)水平的差異

取各組細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)IL-6、Ang(1-7)水平，對(duì)照組、大黃素組、甲磺酸阿帕替尼組及聯(lián)合用藥組的IL-6水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，甲磺酸阿帕替尼組顯著低于大黃素組，聯(lián)合用藥組顯著低于大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組；與IL-6相反，大黃素組、甲磺酸阿帕替尼組及聯(lián)合用藥組的Ang(1-7)水平高于對(duì)照組，其中聯(lián)合用藥組最高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 四組PANC-1細(xì)胞上清液中IL-6、Ang(1-7)水平比較Tab 1 Comparison of levels of IL-6, Ang(1-7) in the cell supernatant of PANC-1 cell among four groups

3.3 Western blot方法檢測(cè)ACE2、Mas受體蛋白水平

用大黃素、甲磺酸阿帕替尼等藥物干預(yù)PANC-1細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定不同組別ACE2、Mas受體蛋白水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組ACE2、Mas受體蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，聯(lián)合用藥組表達(dá)最高，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

表2 四組PANC-1細(xì)胞ACE2、Mas受體蛋白水平比較Tab 2 Comparison of levels of ACE2 and Mas receptors protein in the cell supernatant of PANC-1 cell among

C.對(duì)照組；A.甲磺酸阿帕替尼組；E.大黃素組；A+E.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組C.control group; A.apatinib mesylate group; E.emodin group; A+E.apatinib mesylate+emodin group圖3 四組細(xì)胞ACE2、Mas受體蛋白表達(dá)情況Fig 3 Expression of ACE2 and Mas receptor protein in four groups

3.4 免疫熒光檢測(cè)ACE2、Mas受體蛋白表達(dá)水平

Mas受體陽(yáng)性表達(dá)呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；ACE2表達(dá)部位在胰腺癌細(xì)胞的胞漿中；Mas表達(dá)部位在胰腺癌細(xì)胞膜。大黃素組及甲磺酸阿帕替尼單藥組ACE2及Mas受體表達(dá)高于對(duì)照組，聯(lián)合用藥組表達(dá)明顯最高，見(jiàn)圖4—5。

A.對(duì)照組；B.甲磺酸阿帕替尼組；C.大黃素組；D.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組A.control group; B.apatinib mesylate group; C.emodin group; D.apatinib mesylate+emodin group圖4 四組細(xì)胞ACE2蛋白表達(dá)情況Fig 4 Expression of ACE2 protein in four groups

A.對(duì)照組；B.甲磺酸阿帕替尼組；C.大黃素組；D.甲磺酸阿帕替尼+大黃素組A.control group; B.apatinib mesylate group; C.emodin group; D.apatinib mesylate+emodin group圖5 四組Mas受體蛋白表達(dá)情況Fig 5 Expression of Mas receptor protein in four groups

4 討論

大多數(shù)胰腺癌患者就診時(shí)已是晚期，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)，目前的治療以化療為主，靶向治療尚未有大的突破[6]。諸多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。其機(jī)制包括啟動(dòng)線粒體誘導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NCOR2和SerRS抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A轉(zhuǎn)錄和腫瘤血管生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]；通過(guò)滅活PI3K/Akt信號(hào)通路在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)耐藥[10]；可能通過(guò)激活RIP1/RIP3軸來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死[11]。因此，大黃素在胰腺癌的治療中起到重要作用[12]。

甲磺酸阿帕替尼片是我國(guó)自主研發(fā)的全球首個(gè)胃癌靶向藥物，其作用機(jī)制為高度選擇性競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的ATP結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤新生血管生成。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲磺酸阿帕替尼本身對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制能力[2]。已有研究結(jié)果證實(shí)，多種中藥的提取物對(duì)胰腺癌細(xì)胞可起到抑制其增殖的作用[13-14]。大黃素是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效成分之一，能夠抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖，具有促細(xì)胞凋亡的作用[15]。本研究觀察了大黃素、甲磺酸阿帕替尼單藥及二者聯(lián)合使用對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用；關(guān)于各組IL-6水平的比較，甲磺酸阿帕替尼組明顯低于大黃素組，聯(lián)合用藥組明顯低于大黃素組及甲磺酸阿帕替尼組。IL-6是核因子κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游炎癥介質(zhì)，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子3，阻斷炎癥過(guò)程中的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖。各用藥組IL-6水平的下調(diào)有助于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)均為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的作用底物[16]。ACE2的主要生物學(xué)作用是水解Ang Ⅱ生成Ang(1-7)[17]。Ang(1-7)通過(guò)其特異性受體(為Mas原癌基因編碼的G蛋白耦聯(lián)受體，Mas受體)，即ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，在人體多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮舒張血管、抗炎、抗凝以及保護(hù)血管內(nèi)皮等作用[5]。既往研究結(jié)果證實(shí)了ACE2在胰腺中的表達(dá)及其對(duì)胰腺的保護(hù)作用[17]。ACE2可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[18]。有研究結(jié)果認(rèn)為，在腫瘤組織中存在ACE2表達(dá)下調(diào)甚至缺失，且ACE2可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可作為一個(gè)抑癌基因發(fā)揮作用[19]。穩(wěn)定高表達(dá)ACE2基因可抑制獲得性鉑類(lèi)耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[20]。Ye等[17]亦發(fā)現(xiàn)ACE2高水平的肝癌患者的生存期相對(duì)更長(zhǎng)，而低水平的ACE2可作用預(yù)后差的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，大黃素和甲磺酸阿帕替尼均可提高ACE2、Mas受體水平，降低Ang(1-7)水平，實(shí)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸而發(fā)揮抑制胰腺腫瘤的作用。

綜上所述，大黃素、甲磺酸阿帕替尼能夠通過(guò)上調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，下調(diào)IL-6水平，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制作用更為明顯，可起到協(xié)同效應(yīng)，從而為大黃素和甲磺酸阿帕替尼在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。