蛋白酶法制備低苦味低分子量南極磷蝦蛋白肽混合物初探

夏天晴,李晨豪,李在祿,趙福江,徐麗麗,3,4*,鮑曉明,3

1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院,濟(jì)南 250353 2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物研究所,濟(jì)南 250103 3.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,青島 266237 4.山東圣琪生物有限公司,濟(jì)寧 273517

南極磷蝦(Antarctic krill)資源儲量豐富穩(wěn)定,是全球海洋中最大的單種可捕生物資源[1],南極磷蝦資源尚無明確權(quán)屬,在海洋資源的開發(fā)和爭奪日趨激烈的大環(huán)境下,加快和提高南極磷蝦資源開發(fā)利用具有重要的戰(zhàn)略性意義。南極磷蝦渾身是寶,被加工成凍蝦、蝦干、蝦仁、蝦醬等初級產(chǎn)品；南極磷蝦營養(yǎng)價值很高,含有豐富的蝦青素、維生素AD和B、磷脂、不飽和脂肪酸DHA和EPA等,可被深加工成南極磷蝦油,具有一定的市場占有率,但對南極磷蝦整體利用率尚有待提高,高附加值產(chǎn)品較少[2]。南極磷蝦中蛋白質(zhì)含量豐富,干重可達(dá)70%以上,其含有18種常見氨基酸,包括8種人體必需氨基酸(EAA)[3],經(jīng)提取磷蝦油后產(chǎn)生了大量的脫脂蝦粉,目前主要用作水產(chǎn)飼料原料[4],其中含有大量蛋白質(zhì)和營養(yǎng)成分,提高對這些蛋白質(zhì)和營養(yǎng)成分利用對南極磷蝦資源綜合利用具有重要意義。

近年來,關(guān)于蛋白多肽的研究日益增多,研究表明小分子肽具有更高活性,且更易被人體吸收[5],具有較低分子量的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物已被證實具有對人體及動物有益的生物活性[6-9],目前蛋白肽水解物大多數(shù)用作動物飼料,由于制備蛋白多肽過程中,容易產(chǎn)生苦味,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。WIESER和BELITZ證實蛋白酶酶解后產(chǎn)生的苦味主要是由于蛋白酶酶解過程中,蛋白質(zhì)分子的疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露出來,產(chǎn)生了呈現(xiàn)苦味的短肽即苦味肽,苦味程度與側(cè)鏈的性質(zhì)和數(shù)量,以及整個分子的疏水性有關(guān)[10]。因此,蛋白質(zhì)的性質(zhì),蛋白酶種類和水解程度等因素均有可能影響苦味的產(chǎn)生。由于對各種蛋白酶特點(diǎn)沒有完全認(rèn)知,其水解位點(diǎn)具有不確定性,此外,原料中氨基酸組成和排列順序具有不確定性,很難控制苦味的產(chǎn)生。故本文研究了六種市售蛋白酶酶制劑對脫脂南極磷蝦粉的酶解效果,并利用感官評定的方法對酶解產(chǎn)物進(jìn)行苦味評定,初步確定了各種蛋白酶的酶解效果,篩選出了酶解效果較高,去除苦味較佳的蛋白酶組合,為今后南極磷蝦蛋白肽應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

脫脂南極磷蝦粉,由齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)趙福江老師提供；堿性蛋白酶(≥100 000 U/g)、中性蛋白酶(≥50 000 U/g)、風(fēng)味中性蛋白酶(≥150 000 U/g)、氨基肽酶(≥60 000 U/g),山東隆大生物工程有限公司；風(fēng)味酶(≥10 000 U/g)和木瓜蛋白酶(≥200 000 U/g),廣西南寧龐博生物工程有限公司；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒、超低分子量蛋白質(zhì)Marker(3.3～31.0 kDa),北京索萊寶科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～260 kDa),賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰氨、甲叉丙烯酰胺、10% 過硫酸銨、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、Tris堿、鹽酸、戊二醛、乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲醇、乙酸等均為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實驗儀器

DK-8B恒溫水浴槽、DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Fresco17臺式高速離心機(jī),賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),美國Millipore公司；PB-10酸度計、電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司；SDS-PAGE電泳儀；小型蛋白轉(zhuǎn)印槽。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫脂南極磷蝦粉中總蛋白質(zhì)含量測定

脫脂南極磷蝦粉中總蛋白含量采用凱氏定氮法測定[11],蛋白質(zhì)含量計算如下:

(1)

公式(1)中,X為脫脂南極磷蝦粉中總蛋白質(zhì)的含量(g/g)；V1為樣品消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)；V2為試劑空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)；C為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度(mol/L)；0.014為1 mL硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)；m為樣品的質(zhì)量(g)；V3為吸取消化液的體積(mL)；6.25為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

1.3.2 脫脂南極磷蝦多肽的制備

以干燥后的脫脂南極磷蝦粉為原料,按照一定料液比加水混合,選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味中性蛋白酶、氨基肽酶、風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶六種蛋白酶分別在最適酶解條件下(表1所示)酶解3 h,酶解結(jié)束后,沸水浴處理10 min滅活,冷卻后,利用離心機(jī)5 000 r/m離心15 min,獲得酶解上清液,其中含有部分可溶性大分子量蛋白、多肽和氨基酸。

表1 蛋白酶酶解條件

1.3.3 蛋白酶酶解效果評價

以酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)評價各蛋白酶酶解效果。酶解上清液中蛋白含量(mg/g)采用Folin-酚法(即Lowry法)測定,操作按照Lowry法蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行,在650 nm處測定光吸收值,計算蛋白濃度,以蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)650為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為:y=0.033 9x+0.026 4,R2=0.997 4。

1.3.4 感官品評

采用感官品評的方法對酶解上清液進(jìn)行苦味評定[12-13]。將酶解上清液pH調(diào)整到7.0,挑選7名無感官問題的品評人員進(jìn)行品評,評定人員要求在苦味評定前2 h禁水進(jìn)食,評價員用蒸餾水漱口之后,品評待評定液,10 s后吐出,漱口后間隔5 min品評標(biāo)準(zhǔn)液,評定人員參照標(biāo)準(zhǔn)去對樣品進(jìn)行評定(如表2),取平均值表示苦味程度。

表2 苦味值的評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 SDS-PAGE電泳分析

選取4%的分離膠和15%濃縮膠對酶解上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳,具體溶液配置如表3所示,取適量蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混勻,加入點(diǎn)樣孔。先用80 V電壓持續(xù)電泳,至溴酚藍(lán)指示劑前沿進(jìn)入濃縮膠與分離膠的界面時,再調(diào)整電壓至110 V,至指示劑前沿到達(dá)分離膠前沿1～2 cm處停止電泳,取出凝膠在固定液(0.5%戊二醛30%乙醇混合液)進(jìn)行固定處理20 min。采用考馬斯亮藍(lán)G250方法進(jìn)行染色[14],再用對應(yīng)脫色液脫色,放置在脫色搖床上每隔3 h更換一次脫色液,直至各條帶清晰。

表3 凝膠配置 mL

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3次,結(jié)果表示均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)處理采用Excel和Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂南極磷蝦粉中蛋白含量測定

經(jīng)凱氏定氮法測定[11],脫脂南極磷蝦粉中蛋白質(zhì)含量為71.98%,與全沁果等報道基本一致[15]。

2.2 不同料液比對蛋白酶酶解效果的影響

料液比可能影響蛋白酶對脫脂南極磷蝦粉的酶解效果。研究分別以料液比1∶3、1∶5、1∶7、1∶9和1∶10,在溫度為50 ℃,pH為10.5,酶底物濃度為3%,酶解時間為3 h的條件下,利用堿性蛋白酶酶解脫脂南極磷蝦粉,以Folin-酚法測定的酶解上清液中的可溶性蛋白質(zhì)(包括大分子量蛋白質(zhì)和小分子量多肽)含量為指標(biāo),評估料液比對堿性蛋白酶的酶解效果的影響,由圖1可知,隨著料液比的增加,酶解上清液中可溶性蛋白含量隨之增加,料液比為1∶9時,酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量最高,為0.62 g/g,酶解效果較好；料液比為1∶10時,酶解上清液中蛋白含量變化不大,綜合考慮,選擇1∶9的料液比進(jìn)行后續(xù)酶解。

圖1 不同料液比對脫脂南極磷蝦粉酶解效果的影響

2.3 不同蛋白酶對脫脂南極磷蝦蛋白的酶解效果比較

以Folin-酚法測定的酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量為指標(biāo),評價6種蛋白酶的酶解效果如圖2所示,堿性蛋白酶處理得到的酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量最高,可達(dá)0.62 g/g,酶解效果最好；中性蛋白酶和風(fēng)味酶次之,酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量分別為0.56 g/g和0.51 g/g；風(fēng)味中性蛋白酶處理得到的酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量為0.33 g/g,酶解效果略低；氨基肽酶和木瓜蛋白酶處理得到的酶解上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量僅有0.12 g/g,酶解效果最低。酶解效果較好的堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味酶中均含有作用廣泛的內(nèi)切蛋白酶或同時含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶；風(fēng)味中性蛋白酶也含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶,但主要作用于肽鏈C端或N端的疏水性氨基酸形成的肽鍵,酶解效果略低；木瓜蛋白酶雖然也屬于內(nèi)切肽酶,但其對含巰基(—SH)肽鏈特異性較強(qiáng),因此呈現(xiàn)出較差的酶解效果；而氨基肽酶屬于外切肽酶,酶解效果也較差,說明脫脂南極磷蝦蛋白的徹底酶解需要內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶協(xié)同作用。

圖2 不同蛋白酶對脫脂南極磷蝦粉的酶解效果比較

對各蛋白酶的酶解上清液進(jìn)行感官評定,結(jié)果如圖3所示,利用酶解效果較好的堿性蛋白酶和中性蛋白酶處理得到的酶解上清液苦味值最高,為8.27和8.11,處于較苦等級；具有改善風(fēng)味作用的氨基肽酶、風(fēng)味中性蛋白酶和風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物的苦味值均不高,分別為2.33、2.7和2.81,處于微苦等級；而木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的苦味值也不高,為3.29,推測木瓜蛋白酶酶解效率較低,產(chǎn)生的苦味肽也少。

圖3 不同蛋白酶酶解上清液的感官品評結(jié)果

2.4 復(fù)配蛋白酶組合的酶解效果和酶解產(chǎn)物評價

我們最終確定了酶解效果較好的是堿性蛋白酶和中性蛋白酶,風(fēng)味酶酶解效果次之,酶解效果較差的是氨基肽酶、風(fēng)味中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；酶解效果較好的蛋白酶在酶解過程中往往產(chǎn)生的苦味多,這是由于苦味肽是伴隨酶解過程中產(chǎn)生的,為了達(dá)到同時提高脫脂南極磷蝦蛋白的酶解效果和減少酶解產(chǎn)物苦味產(chǎn)生的目的,我們從以上六種蛋白酶中選擇了酶解效果較好的堿性蛋白酶與能減少苦味產(chǎn)生效果較好且酶解效果較高的風(fēng)味酶以1∶1配比,將堿性蛋白酶與風(fēng)味酶及氨基肽酶以1∶1∶1配比(復(fù)配蛋白酶組合2)依次酶解(根據(jù)表1中所列酶解條件進(jìn)行),以酶解上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量為指標(biāo),評估復(fù)配蛋白酶組合的酶解效果,結(jié)果如圖4所示,兩個復(fù)配蛋白酶組合酶解產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)含量均高于單一蛋白酶,特別是復(fù)配蛋白酶組合2的酶解上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量比單一堿性蛋白酶提高了13%。對酶解上清液進(jìn)行感官評定,結(jié)果如圖5所示,兩個復(fù)配蛋白酶組合的酶解上清液的苦味強(qiáng)度均明顯低于單一堿性蛋白酶,其中復(fù)配蛋白酶組合1的酶解上清液苦味強(qiáng)度為5.56,復(fù)配蛋白酶組合2的酶解上清液苦味強(qiáng)度接近風(fēng)味酶,僅為3.69,苦味強(qiáng)度降低為微苦等級。說明堿性蛋白酶能較好的酶解脫脂南極磷蝦粉,同時也產(chǎn)生了較強(qiáng)的苦味,現(xiàn)有風(fēng)味酶能較好地降低脫脂南極磷蝦多肽混合物的苦味強(qiáng)度,但有可優(yōu)化的空間,添加氨基肽酶可進(jìn)一步降低其苦味強(qiáng)度。

圖4 復(fù)配蛋白酶組合對脫脂南極磷蝦粉的酶解效果比較

圖5 復(fù)配蛋白酶組合酶解上清液的感官品評結(jié)果

通過考馬斯亮藍(lán)染色法[14]得到如圖6所示復(fù)配蛋白酶組合與單一蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白電泳條帶,通過對比分析,未經(jīng)酶解的上清液中除了含有分子量較高的蛋白外,也有少量低分子量蛋白(圖6,泳道1),這些蛋白可能是在脫脂過程中產(chǎn)生的；經(jīng)復(fù)配蛋白酶組合2酶解的產(chǎn)物分子量主要集中在14.4 kDa以下(圖6,泳道2)；而復(fù)配蛋白酶組合1、堿性蛋白酶和風(fēng)味酶的酶解產(chǎn)物分子量跨度比較大,一部分集中在14.4 kDa以下,另外還產(chǎn)生了其它5條明顯的蛋白質(zhì)條帶,其分子量分布在30～260 kDa之間(圖6,泳道3,4和5),說明堿性蛋白酶、風(fēng)味酶及復(fù)配組合1(堿性蛋白酶+風(fēng)味酶)酶解不完全；經(jīng)氨基肽酶酶解的產(chǎn)物主要集中在14.4 kDa以下(圖6,泳道6),還有一部分大分子量蛋白分布。復(fù)配組合2蛋白酶組分豐富,酶解較完全,能將大部分脫脂南極磷蝦蛋白水解成分子量較小的產(chǎn)物,說明脫脂南極磷蝦蛋白的水解需要各種蛋白酶協(xié)同作用。

注:M1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1,從小到大依次為3.3、6.5、14.4、20.1和31 kDa；M2:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)2,從小到大依次為10、15、25、35、45、60、75、100、140和260 kDa；泳道1:未經(jīng)酶解的負(fù)對照；泳道2:復(fù)配蛋白酶組合2酶解；泳道3:復(fù)配蛋白酶組合1酶解；泳道4:堿性蛋白酶酶解；泳道5:風(fēng)味酶酶解；泳道6:氨基肽酶酶解

3 結(jié) 論

采用六種蛋白酶即堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味中性蛋白酶、氨基肽酶、風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶分別酶解脫脂南極磷蝦粉,通過評價蛋白酶的酶解效率、酶解產(chǎn)物的苦味值和分子量,確定了堿性蛋白酶(含有內(nèi)切蛋白酶)的酶解效果較好,產(chǎn)生苦味最少的蛋白酶是氨基肽酶、風(fēng)味中性蛋白酶和風(fēng)味酶(均含有外切肽酶),說明提高脫脂南極磷蝦蛋白的酶解效果和減少苦味產(chǎn)生需要內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶協(xié)同作用。我們將酶解效果最佳的堿性蛋白酶與產(chǎn)生苦味較少的風(fēng)味酶以及氨基肽酶(即復(fù)配蛋白酶組合2)依次酶解,與單一堿性蛋白酶相比,產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)含量提高了13%,酶解產(chǎn)物的苦味值降低了55%,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示該復(fù)配蛋白酶組合的酶解產(chǎn)物分子量較集中,在14.4 kDa以下。我們也注意到各蛋白酶組分所占比例對酶解效率和苦味產(chǎn)生影響較大,目前,尚不能確定酶解的產(chǎn)物含有多少個氨基酸的短肽。下一步將進(jìn)一步優(yōu)化內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的配比,分析酶解產(chǎn)物的分子量分布,以實現(xiàn)適用于酶解脫脂南極磷蝦蛋白的蛋白酶精準(zhǔn)定制,形成制備南極磷蝦多肽的成熟工藝。