基于分子對接探究熊果酸衍生物H21對引起炎癥的關(guān)鍵蛋白的作用

宋瑗瑗, 曹洪玉, 未志俞, 王 倩, 蔣 革*

(1. 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622； 2. 大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622)

據(jù)統(tǒng)計，近年來非甾體抗炎藥用量僅次于抗菌藥物，消耗量巨大，但其長期大劑量服用可導(dǎo)致胃腸道、肝臟、血液系統(tǒng)以及心臟甚至是皮膚的損害等[1-4]，如阿司匹林、布洛芬. 目前，開發(fā)抗炎效果良好、毒副作用少的藥物研究較多，但對其抗炎作用機(jī)制研究較少[5-6].

熊果酸(UA)是一種存在于多種植物中的五環(huán)三萜類化合物. 未志俞等[7]以熊果酸為原料，通過對C28位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾合成了熊果酸衍生物H21，其抗炎效果優(yōu)于同劑量的布洛芬和吲哚美辛，但H21的抗炎作用機(jī)制尚不明確[8].

基于分子對接的虛擬篩選技術(shù)作為輔助藥物設(shè)計的一項重要方法，在揭示藥物與機(jī)體靶點的作用機(jī)制以及在新藥研發(fā)的過程中發(fā)揮著極大的作用[9]. 以融合基因 Bcr-Abl為靶點，通過分子對接等技術(shù)篩選出候選化合物STI571，它在體外能夠選擇性抑制Bcr-Abl 蛋白活性，并能在體內(nèi)外抑制Bcr-Abl表達(dá)細(xì)胞的增殖，而不作用于正常細(xì)胞,這就是首個上市的分子靶向藥物——格列衛(wèi)，其開創(chuàng)了腫瘤分子靶向治療的新時代[10]. 暨南大學(xué)藥學(xué)院在新選擇性DDR1單抑制劑的基礎(chǔ)上，通過分子對接等技術(shù)篩選DDR1和DDR2高選擇性雙重抑制劑，最終得到化合物5N[11]. 實驗表明，5N在體內(nèi)外均有良好的抗炎作用，這也是首次在體內(nèi)研究高選擇性DDR1和DDR2雙重抑制劑作為新型抗炎藥[11]. 目前，基于分子對接方法的虛擬篩選已經(jīng)成為針對特定靶蛋白藥物研發(fā)的必備流程之一[12].

分子對接等計算機(jī)輔助藥物設(shè)計方法相比于其他傳統(tǒng)的篩選方法，能夠有效提高篩選效率[13]. 為了探討熊果酸衍生物H21的抗炎作用機(jī)制，本論文利用了計算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計尋找藥物活性靶技術(shù)[2]. 該技術(shù)通過分子模擬篩選和分子對接，從構(gòu)建的蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選出與藥物分子結(jié)合較好的靶標(biāo)蛋白，分析二者之間的相互作用，這樣能夠準(zhǔn)確研究藥物作用機(jī)理，進(jìn)而減少研究藥物作用機(jī)理的實驗成本和時間[14-16].

因此，本研究利用該技術(shù)的優(yōu)點和靈活性，通過反向?qū)拥姆椒?，運用分子對接篩選四大經(jīng)典炎癥通路中與H21結(jié)合較好的靶蛋白，分析H21與炎癥因子的相互作用形式，進(jìn)而探究H21發(fā)揮抗炎作用的作用機(jī)制和作用靶點，為揭示H21的抗炎機(jī)制和作用靶點提供理論依據(jù).

1 研究方法

1.1 靶標(biāo)蛋白的確定

JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-like通路是經(jīng)典的炎癥通路. 從4條通路(JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-Like)中選取關(guān)鍵靶蛋白，從UniProt(https://www.uniprot.org/)網(wǎng)站中篩選上述靶蛋白，篩選依據(jù)是：(1)選擇來源：人源;(2)配體：選擇只含一個配體的，選擇含有配體的原因是因為以原配體和蛋白的對接分?jǐn)?shù)為基準(zhǔn)，若藥物分子和靶蛋白對接分?jǐn)?shù)優(yōu)于原配體和靶蛋白的對接分?jǐn)?shù)，說明藥物分子對接效果優(yōu)于原配體對接效果，即對接結(jié)果較好，反之亦然;(3)基因：無突變基因的靶蛋白;(4)分辨率：盡可能選擇分辨率高的蛋白. 靶標(biāo)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)在RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)網(wǎng)站下載.

1.2 H21和原配體的優(yōu)化

利用軟件ChemDraw Ultra8.0以及Chem 3D 17.1構(gòu)建抗炎藥物H21的3D結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入Maestro 11.2中，利用“Ligprep”工具以“OPLS_2005”力場進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，將H21和靶標(biāo)蛋白原配體結(jié)果保存為“·mae”文件格式用于后續(xù)分子對接[17].

1.3 靶標(biāo)蛋白優(yōu)化及活性位點的預(yù)測

利用Maestro 11.2“Protein Preparation Wizard ”工具對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行加氫、去水等結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以“Sitemap”程序預(yù)測靶標(biāo)蛋白潛在的活性位點. 以“Receptor Grid Generation”程序確定預(yù)測的活性位點.

1.4 分子對接

通過“Ligand Docking”工具，將最小化的靶蛋白和其優(yōu)化后的原配體進(jìn)行分子對接，并且將H21與靶蛋白的不同活性位點分別進(jìn)行對接.

以“Glide-gscore”和“Glide-energy”得分函數(shù)值評價小分子與靶蛋白的相互作用，該函數(shù)綜合考慮了氫鍵、疏水、范德華力等相互作用，其絕對值越大，表明小分子與靶蛋白的對接復(fù)合物越穩(wěn)定、匹配結(jié)合作用越好. 通過抗炎藥物H21和靶蛋白對接以及原配體和靶蛋白對接分?jǐn)?shù)的比較，并分析二者的相互作用.

2 結(jié)果與討論

分子對接是依據(jù)“誘導(dǎo)契合學(xué)說”原理，從已知結(jié)構(gòu)的受體和配體出發(fā)， 通過化學(xué)計量方法模擬、識別并預(yù)測受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的方法[18].H21結(jié)構(gòu)如圖1.

圖1 抗炎藥物H21結(jié)構(gòu)

2.1 Glide-gscore分析

從4條通路(JAK-STAT、NF-κB、MAPK、Toll-like)中選取關(guān)鍵靶蛋白，共29個靶蛋白，共預(yù)測有133個活性位點，其中有6個靶蛋白的活性位點并未對接成功，選取29個靶蛋白的多個活性位點中Glide-gscore絕對值最大的記錄打分值匯總結(jié)果見表1. 其中，NF-κB和Toll-like通路對接效果總體優(yōu)于JAK-STAT和MAPK通路，Toll-like通路中IRAK1蛋白對接效果優(yōu)于IRAK4，IRAK1 Glide-gscore為-9.873，在29個靶蛋白中對接效果突出.

表1 靶蛋白與H21對接匯總Table1 The docking summary of target protein and H21

2.2 H21與IRAK1相互作用分析

分析IRAK1與抗炎藥物H21的相互作用如圖2，IRAK1蛋白與H21形成分子口袋如圖3. Glu215側(cè)鏈上的羧基與熊果酸衍生物H21的羥基形成氫鍵相互作用，Leu291與Phe290形成的肽鍵與H21雜環(huán)上的氧形成氫鍵相互作用. 抗炎藥物H21與氨基酸Ile218、Val226、Ala237、Val272、Tyr288、Phe290、Leu291、Pro292、Leu347、Cys302、Ala306、Cys307形成疏水相互作用.

圖2 IRAK1受體與H21的相互作用

圖3 IRAK1受體與H21的分子口袋

2.3 原配體與IRAK1相互作用分析

分析IRAK1與原配體的相互作用如圖4，IRAK1蛋白與原配體形成分子口袋如圖5. 原配體與氨基酸Asp298、Ile218、Glu220形成氫鍵相互作用，同時與Asp298形成鹽橋相互作用.

抗炎藥物H21與原配體均能與IRAK1氨基酸Ile218等形成關(guān)鍵相互作用，且H21Glide-gscore為-9.873，原配體Glide-gscore為-4.773，H21Glide-gscore優(yōu)于原配體，理論結(jié)果表明H21與IRAK1的結(jié)合優(yōu)于原配體.

白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)是一種絲氨酸蘇氨酸激酶[19-20]，位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，是Toll-like受體和白細(xì)胞介素-1受體信號傳遞過程的關(guān)鍵節(jié)點，具有介導(dǎo)Toll-like受體和IL-1信號通路的作用[21]. Toll-like 通路介導(dǎo)的信號通路控制多種細(xì)胞的生理代謝過程，如炎癥，凋亡和細(xì)胞分化等[22].

圖4 IRAK1受體與原配體的相互作用

圖5 IRAK1受體與原配體的分子口袋

3 結(jié)論

熊果酸衍生物H21具有良好的抗炎效果及較低的細(xì)胞毒性，但其抗炎機(jī)制尚不明確. 通過分子對接探究經(jīng)典炎癥通路中分泌炎癥因子的關(guān)鍵蛋白，初步篩選了熊果酸衍生物H21發(fā)揮抗炎作用的靶蛋白. 先天性免疫信號傳導(dǎo)在炎癥中起著至關(guān)重要的作用，白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族成員是先天免疫中Toll-like受體和IL-1受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，因此可作為疾病的潛在治療靶標(biāo)[23]. 其中，IRAK1作為Toll-like受體和信號傳遞過程的關(guān)鍵節(jié)點，在介導(dǎo)Toll-like受體和信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用. 抗炎藥物H21與Toll-like通路中IRAK1蛋白結(jié)合較好，H21與IRAK1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸為Ile218. 理論數(shù)據(jù)表明抗炎藥物H21其可能影響IRAK1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，后續(xù)研究可以通過細(xì)胞實驗及結(jié)合實驗驗證抗炎藥物H21對IRAK1蛋白的作用.

本研究利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計通過分子對接的方法預(yù)測了抗炎藥物H21的作用靶點和作用機(jī)制，為研究抗炎藥物H21的抗炎機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)，減少了研究成本和時間，也為揭示其他藥物的作用機(jī)制提供了新的思路和方向.