吉林部分地區(qū)TTSuVs與PCV2混合感染情況調(diào)查及其與PMWS相關(guān)性分析

劉東旭，沙萬里,尹柏雙,李國江*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林省教育廳預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林 吉林 132101)

仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)是一種重要的病毒性傳染病，它能造成仔豬全身各系統(tǒng)不同程度的功能喪失。該病主要由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus tape 2，PCV2)引起[1]。豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno sus viruses，TTSuVs)最早發(fā)現(xiàn)于2002年，現(xiàn)流行于多個國家的豬群中，目前被分成2個基因型，即TTSuV1和TTSuV2[2]。臨床研究表明，豬群單一感染TTSuVs并不能引起明顯的臨床癥狀；豬群單一感染PCV2也同樣不會引起明顯的臨床癥狀，但豬群混合感染兩種病原體時，會促進(jìn)PMWS的發(fā)生。這使得關(guān)于TTSuVs在豬群中的感染情況及潛在的致病性成為研究的熱點(diǎn)[3]。

為此，本研究對吉林部分地區(qū)TTSuVs與PCV2混合感染情況進(jìn)行調(diào)查，并分析PMWS病豬及PCV2亞臨床感染豬體內(nèi)TTSuVs的載量，這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識TTSuVs在豬群中的感染情況及其潛在致病性，為研究TTSuVs的致病機(jī)理及PCV2等疾病的防制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒基因組提取試劑盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、RNaseA，購自TaKaRa公司。

1.2 血清樣品

2019年1月起從吉林省10家規(guī)?；i場隨機(jī)收集到的血清樣品130份。

1.3 引物及探針

檢測應(yīng)用實(shí)驗室已有的PCV2和TTSuVs熒光定量PCR引物和探針，引物和探針具體信息見表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 1 PCR primer sequence information

1.4 TTSuVs和PCV2流行情況調(diào)查

將2019年1月起從吉林省10家規(guī)?；i場收集到的130份血清樣品，按照TaKaRa公司病毒基因組提取試劑盒說明書提取病毒DNA。應(yīng)用劉建波等[4]建立設(shè)計的TTSuVs及PCV2引物對提取的病毒基因組進(jìn)行PCR檢測，并統(tǒng)計分析吉林地區(qū)2019年TTSuVs和PCV2的感染情況。

1.5 PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品的確定

應(yīng)用本實(shí)驗室已建立好的PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法對血清樣品中PCV2的濃度進(jìn)行檢測(擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，56.6 ℃ 30 s；35個循環(huán))，根據(jù)血清樣品中的PCV2濃度，應(yīng)用公式：Copies/mL=6.02×1023×濃度/平均分子量，計算病毒拷貝數(shù)，并根據(jù)計算結(jié)果區(qū)分PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品。

1.6 TTSuVs載量與PMWS相關(guān)性分析

應(yīng)用本實(shí)驗室已建立好的TTSuVs TaqMan熒光定量PCR檢測方法對1.5中的PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品進(jìn)行TTSuVs載量分析(TTSuV1擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，54.6 ℃ 30 s；35個循環(huán)。TTSuV2擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；變性，95 ℃ 10 s；退火，55.6 ℃ 30 s；35個循環(huán))。用t檢驗方法對PMWS病豬和PCV2亞臨床感染豬PCV2載量、TTSuVs載量分別進(jìn)行差異顯著性分析，并對三種病毒載量進(jìn)行直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉林部分地區(qū)TTSuVs和PCV2流行情況調(diào)查

對2019年1月起從10家規(guī)模化豬場收集到的130份血清樣品進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見表2。其中共檢出50份TTSuV1陽性樣品，其感染率為38.46%；75份TTSuV2陽性樣品，感染率為57.69%；60份PCV2陽性樣品，感染率為46.15%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染樣品有41份，混合感染率為31.54%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣品有42份，混合感染率為32.30%；TTSuV2與PCV2的混合感染樣品有58份，混合感染率為44.62%；三種病毒的混合感染樣品有29份，混合感染率為22.30%。且中部地區(qū)為吉林主要發(fā)病地區(qū)，結(jié)果見表3。

表2 2019年吉林地區(qū)TTSuVs和PCV2流行情況調(diào)查Table 2 Epidemic survey of TTSuVs and PCV2 in Jilin in 2019

表3 吉林地區(qū)2018年TTSuVs及PCV2分布情況Table 3 Distribution of TTSuVs and PCV2 in Jilin Region in 2018

2.2 PMWS病豬樣品及PCV2亞臨床感染樣品的確定

對PCV2陽性病料，應(yīng)用本實(shí)驗室已建立的熒光定量PCR檢測方法對其中PCV2的載量進(jìn)行測定。資料顯示，PCV2感染豬發(fā)展成為PMWS病豬所需要的病毒載量的臨界值是，每微升血清中含有的病毒載量為1×104copies[5]。故參考這個標(biāo)準(zhǔn)，將血清中PCV2載量低于1×104copies/μL的判定為PCV2亞臨床感染，將血清中PCV2載量高于1×104copies/μL的判定為PMWS病豬。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)檢測的130份樣品中個，PCV2亞臨床感染45份，PMWS病豬47份。其中PMWS病豬血清中PCV2載量范圍介于104.13～106.91copies/μL之間，平均值為105.32copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中PCV2載量范圍介于100.91～103.68copies/μL之間，平均值為101.72copies/μL。PMWS病豬血清中PCV2載量高于PCV2亞臨床感染豬，并且二者之間差異性顯著(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 PMWS病豬、PCV2亞臨床感染豬血液樣本中三種病毒載量比較Table 4 Comparison of three viral loads in blood samples from PMWS diseased pigs and PCV2 subclinically infected pigs(Log10(DNA)(copies/μL))

2.3 PCV2亞臨床感染豬與PMW病豬的TTSuVs載量比較分析

對檢測的45份PCV2亞臨床感染樣本和47份PMWS病豬樣本，用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測其中的TTSuVs載量。結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，PMWS病豬血清中TTSuV1載量范圍介于0～103.21copies/μL之間，平均值為101.36copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中TTSuV1載量范圍介于0～103.12copies/μL之間，平均值為101.58copies/μL。PMWS病豬血清中TTSuV1載量與PCV2亞臨床感染豬TTSuV1載量差異性不顯著(P>0.05)。PMWS病豬血清中TTSuV2載量范圍介于0～103.52copies/μL之間，平均值為102.24copies/μL；PCV2亞臨床感染豬中TTSuV2載量范圍介于0～102.42copies/μL之間，平均值為101.34copies/μL。PMWS病豬血清中TTSuV2載量高于PCV2亞臨床感染豬，并且二者之間差異性顯著(P<0.05)。

2.4 TTSuV2載量與PCV2載量的相關(guān)性分析

通過上述數(shù)據(jù)分析可見，PMWS病豬血清中TTSuV2載量是高于PCV2亞臨床感染豬的，并且二者之間差異性達(dá)到了顯著水平，因此有必要進(jìn)一步分析其間是否存在一定程度的相關(guān)性。將PCV2感染豬中PCV2載量的對數(shù)值與TTSuV2載量的對數(shù)值進(jìn)行直線相關(guān)與回歸分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，二者之間存在部分?jǐn)M合性(R2=0.3441)，提示臨床上TTSuV2感染與PMWS發(fā)生之間存在一定關(guān)聯(lián)。

圖1 血清中TTSuV2載量和PCV2載量之間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis on TTSuV2 load and PCV2 load in serum

3 討 論

PMWS的出現(xiàn)以及爆發(fā)對我國養(yǎng)豬行業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。PMWS可見于5～16周齡豬，但最常見于6～8周齡。豬群患病率為3%～50%，死亡率在8%～35%。發(fā)病豬中大約有半數(shù)于2～8d內(nèi)死亡，其他半數(shù)豬在衰弱狀態(tài)下可存活數(shù)周，幾乎沒有康復(fù)的豬，致死率為80%～100%。本病發(fā)展緩慢，豬群一次發(fā)病可持續(xù)12～18個月。成年豬一般為隱性感染，常不表現(xiàn)任何癥狀和病變，但可以排毒。自PMWS報道以來，圍繞著PMWS病原研究一直在進(jìn)行。Ellis等[6]研究表 明PCV2與PMWS高度相關(guān)。然而PCV2是PMWS的主要病因，但可能不是唯一的病原。有研究表明TTSuVs與PCV2的混合感染會導(dǎo)致豬群發(fā)生PWMS。Ellis等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，50%的豬在感染TTSuVl后，再感染PVC2會出現(xiàn)急性PMWS癥狀，而單獨(dú)感染2種病毒的任何一種，或者先感染PCV2再感染TTSuVl均未出現(xiàn)PMWS癥狀，預(yù)示TTSuVl與PCV2混合感染時，可能導(dǎo)致豬群暴發(fā)PMWS。Kekarainen等[7]對西班牙PMWS和非PMWS豬群中TTSuVs感染情況的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，TTSuV2在PMWS發(fā)病豬群中的陽性率比非PMWS豬群明顯偏高。

為此本項目對2019年吉林部分地區(qū)規(guī)模化豬場TTSuVs與PCV2混和感染情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果顯示，TTSuV1其感染率為38.46%；TTSuV2感染率為57.69%； PCV2感染率為46.15%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染率為31.54%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為32.30%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為44.62%；三種病毒的混合感染率為22.30%。與李海超[8](PCV2感染率71.37%，；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為44.05%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為36.12%)和張青占[9]的調(diào)查結(jié)果部分相近(PCV2感染率75.73%；TTSuV1與PCV2的混合感染樣率為32.02%；TTSuV2與PCV2的混合感染率為61.08%)，說明TTSuVs及PCV2混合感染已在我國多省份流行，但流行情況各個地域間差異較大。

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法來檢測TTSuV1、TTSuV2、PCV2的病毒載量，比較PMWS病豬與PCV2亞臨床感染豬的血清中TTSuV1載量、TTSuV2載量、PCV2載量的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMWS病豬的血清中TTSuV2載量極顯著的高于PCV2亞臨床感染豬，兩者之間存在差異性(P<0.01)，但前者的TTSuV1載量與后者并無顯著差異。對所有PCV2感染豬的TTSuV2與PCV2載量的相關(guān)分析結(jié)果顯示，二者之間有顯著相關(guān)，提示TTSuV2感染與PMWS發(fā)生之間可能存在相關(guān)性，這與一些國內(nèi)外研究資料基本一致[10-11]。這些資料除報道PMWS病豬的血液中的TTSuV2載量顯著高于PCV2亞臨床感染豬外，還報道前者的TTSuV2陽性率明顯高于后者；本研究觀察到類似現(xiàn)象。這說明隨著PMWS的發(fā)生，TTSuV2載量同時增加，提示TTSuV2與PCV2之間在一定條件下，二者的混合感染完全可能引起一定比例的PMWS。