一種新的黨參根腐病害鐮孢菌鑒定＊

漆永紅，李敏權(quán)，曹素芳，龔成文，米永偉，武偉國，李雪萍，陳愛昌，孫新榮，李繼平

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物與啤酒原料研究所，甘肅 蘭州 730070；4.定西市植保植檢站，甘肅 定西 743000；5.渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 定西 748200）

黨參（Codonopsis pilosula）為桔?？泣h參屬，多年生草本植物，分布在我國北方山地林邊和灌叢中，海拔高度為1560～3100m。黨參作為傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥，具有補(bǔ)中益氣和健脾益肺的功效[1-2]。根據(jù)黨參的外形和產(chǎn)地，可以分為西黨、潞黨、東黨和條黨等[3]。甘肅省定西市渭源縣是我國的“黨參之鄉(xiāng)”，主要生產(chǎn)白條黨參。隨著甘肅省黨參人工栽培面積逐年擴(kuò)大，生長環(huán)境改變和土壤病原菌數(shù)量不斷積累，黨參根腐病害已成為制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，對當(dāng)?shù)攸h參產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重的影響。

關(guān)于黨參根腐病害國內(nèi)一些學(xué)者有研究，王艷等[4]報道了甘肅省渭源縣和隴西縣黨參根腐病病原菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporiums）。劉春葉等[5]發(fā)現(xiàn)，洛黨參根腐病在田間4 月中下旬發(fā)生，8月份達(dá)到高峰。余中蓮等[6]報道，尖孢鐮孢菌（F.oxysporiums）引起川黨參根腐病。近年來，一種新的黨參根腐病在我省黨參種植區(qū)普遍發(fā)生，當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶誤稱為“黃心病”，由于發(fā)病初期，葉片從綠色逐漸變?yōu)榛揖G色和黃色，內(nèi)部維管束由白色變?yōu)辄S色、黃褐色、褐色至深褐色而得名。據(jù)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一般田間發(fā)病率為15%～30%，嚴(yán)重的達(dá)50%以上，甚至絕收；病原菌在土壤或帶菌參根上越冬，上年已感染參根在5 月中下旬發(fā)病，6～7 月為發(fā)病高峰期；當(dāng)年的參根發(fā)病較晚，6 月中下旬出現(xiàn)發(fā)病癥狀，8月達(dá)到高峰期。該病害在我省黨參種植區(qū)的為害面積逐年增加，尤其以重茬黨參發(fā)病嚴(yán)重，給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于該病害在我省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣等地的病原種類未見報道，本試驗(yàn)擬對我省發(fā)生的一種新的黨參根腐病的發(fā)病癥狀進(jìn)行研究，以確定其病原、致病性及其優(yōu)勢病原種類，為該病害的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與病原菌分離和純化

2018 年6 月在甘肅省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣等主要黨參生產(chǎn)基地采集發(fā)病植株，記錄好采樣信息，裝入自封袋。采用常規(guī)組織分離法[7-8]，剪取發(fā)病維管束5mm×5mm 組織塊在75%酒精中浸泡5s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1min，無菌水漂洗3 次晾干，置于PDA 培養(yǎng)基平板內(nèi)，在25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7d。從菌落邊緣切取菌絲塊置于香石竹葉片瓊脂（CLA）培養(yǎng)基（瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，每皿加入長度1cm 的無菌康乃馨葉片3 片），在25℃培養(yǎng)7～10d。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA 斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

采用柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，將分離純化的病原物PDA 培養(yǎng)基打成10mm 菌餅接種在黨參（渭黨1 號）芽尖部，無菌土掩埋接種部位，每個病原菌接種15 株黨參幼苗，以沒有帶菌的PDA 培養(yǎng)基接種黨參芽尖部作為對照，45 d 后調(diào)查發(fā)病情況，病害分級標(biāo)準(zhǔn)為，0 級：根部無病斑；1 級：根部病斑面積占總根部面積的1/4 以下；3 級：根部病斑面積占總根部面積的1/4～1/2；5 級：根部病斑面積占總根部面積的1/2～3/4；7 級：根部病斑面積占總根部面積的3/4 以上。同時將發(fā)病部位再次分離培養(yǎng)，用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定分離得到的病原菌與初接病原菌是否為同一病原菌。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌分別接種在PDA 和CLA 培養(yǎng)基（促進(jìn)產(chǎn)孢）上，25℃下培養(yǎng)7d 和10d 后，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與分生孢子形態(tài)、大小，根據(jù)Burgess[9]分類方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病原菌種類鑒定。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 真菌基因組DNA 提取

刮取PDA 培養(yǎng)基上的病原菌菌絲，采用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒E.Z.N.ATM.HP Fungal DNA Kit（OMEGA）的方法提取DNA[10]，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分子鑒定的引物

本試驗(yàn)用鐮孢菌特異性引物[11-12]，核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1 和ITS4 序列分別為TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和TCCTCCGCTTATTGATATGC；鐮孢菌特異性引物TEF1αF 和TEF1αR 的序列分別為 ATGGGTAAGGARGACAAGAC 和 GGARGTAC CAGTSATCATGTT。

1.4.3 PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳、測序及序列分析

PCR 擴(kuò)增體系（25μL）：10×Buffer2.5μL、2.5mol·L-1dNTP4μL、10μmol·L-1正反向引物各1μL、Taq 酶0.5μL、DNA 模板1μL，用ddH2O 補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，25 個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩CR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列與GenBank 核酸序列庫進(jìn)行同源性比對分析，并用Mega 6.0Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

地上部葉片由綠色變成黃色和灰綠色（圖1A），出現(xiàn)急性萎蔫，早晚稍有恢復(fù)，天氣晴朗時很快全株萎蔫枯死。病原菌從黨參芽尖部侵入，發(fā)病初期，根外表正常，縱剖根部，內(nèi)部維管束組織自上而下逐漸變?yōu)辄S色、黃褐色、褐色至深褐色（圖1B）；健康植株的內(nèi)部維管束組織呈白色（圖1C）。

圖1 黨參根腐病

2.2 病原菌在田間的分布及種類鑒定

共采集到黨參標(biāo)樣23 份，室內(nèi)分離到鐮孢菌株216 株。4 種鐮孢菌在每個縣區(qū)均有分布，對分離到的菌株進(jìn)行鑒定和統(tǒng)計，尖孢鐮孢菌112 株，占51.85%；茄病鐮孢菌49 株，占22.69%；三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌為34 株和21 株，分別占15.74%和9.72%，其中尖孢鐮孢菌為黨參根腐病的優(yōu)勢種群。各病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征鑒定如下：

菌株編號WDX-4-2-2 尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）：在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色，大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細(xì)，具3～5 個橫隔膜，多為3 個隔，大小為23.0～33.0μm×2.0～4.0μm，足胞明顯；小型分生孢子橢圓形，單胞，無色，大小為3.0～14.5 μm×1.5～3.0μm。

菌株編號DS-3-1-2 茄病鐮孢菌（F.sonali）：在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色，較致密；大型分生孢子無色，較寬，兩端圓，馬特型，2～5 個隔膜，多為3 個隔膜，大小為20.0～38.5μm×3.5～5.5μm；小型分生孢子，橢圓形、腎形，無色，大小為6.5～15.0μm×2.5～4.5μm。

菌株編號DS-4-1 三線鐮孢菌（F.tricinctum）：在PDA 培養(yǎng)基上菌絲羊毛狀，繁茂，白色或粉紅色；大型分生孢子新月形，兩端漸尖，頂細(xì)胞彎曲并逐漸變細(xì)，足細(xì)胞明顯，3～5 分隔，28～50μm×2.5～5.5 μm；小型分生孢子橢圓形或檸檬形，0～1 隔，5.5～17.5μm×3.5～8.5μm。

菌株編號DS-3-1-1 銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）：在PDA 培養(yǎng)基上菌絲白色，茂盛；大型分生孢子鐮刀形，通常4～6 分隔，32.5～82.5μm×2.0～5.5 μm；小型分生孢子紡錘形或腎形，0～1 分隔，多為0分隔。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果與GenBenk 數(shù)據(jù)庫中Nucleotide Blast 進(jìn)行比對，尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）的序列分別為597、544、483 和537bp。用Mega7.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，黨參根腐病與F.oxysporum、F.sonali、F.tricinctum和F.acuminatum 親緣關(guān)系最近（如圖2 所示）。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，把甘肅省臨洮縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、岷縣的黨參根腐病鑒定為尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum）。

圖2 病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 4 種鐮孢菌對黨參的致病性測定結(jié)果

室內(nèi)致病性測試結(jié)果表明，接菌植株表現(xiàn)出與自然病株相同的癥狀，未接菌植株表現(xiàn)正常，從接種發(fā)病黨參植株上全部分離到病原菌，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌。與對照相比，尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌均對黨參有致病性，但發(fā)病率和病情指數(shù)不同（見表1）。尖孢鐮孢菌的致病性最強(qiáng)，發(fā)病率和病情指數(shù)最高，分別為100.0%和46.4，顯著高于茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌，而茄病鐮孢菌、三線鐮孢菌和銳頂鐮孢菌對黨參的致病力較弱，三者差異不顯著。

表1 4 種鐮孢菌對黨參的致病性測定

3 討論

隨著黨參栽培面積的不斷擴(kuò)大和連年種植，病蟲草害等有害生物的為害日益嚴(yán)重，給黨參生產(chǎn)造成的損失越來越大。本試驗(yàn)針對當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶誤稱為黨參“黃心病”開展研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是一種新的黨參根腐病，首次確定了該病害的發(fā)病癥狀和病原菌的侵染方式，病原菌從芽尖侵入，內(nèi)部維管束自上而下變褐色，地上部葉片出現(xiàn)急性萎蔫，導(dǎo)致全株枯死。該病害在我省黨參種植區(qū)普遍發(fā)生，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了黨參產(chǎn)量提高和品質(zhì)提升。

根腐病屬土傳病害，防治比較困難[13]，由于病原物在土壤中可以存活多年。鑒定黨參根腐病害的病原菌是防治的前提條件和基礎(chǔ)，明確病原種類對采取有效和科學(xué)的防治技術(shù)起到關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)初步明確了黨參根腐病的病原為尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）、茄病鐮孢菌（F.sonali）、三線鐮孢菌（F.tricinctum）和銳頂鐮孢菌（F.acuminatum），其中尖孢鐮孢菌為優(yōu)勢種，這表明黨參根腐病害的病原種類復(fù)雜，存在多種鐮孢菌復(fù)合侵染的現(xiàn)象，進(jìn)一步說明了田間黨參根腐病害為害的普遍性和嚴(yán)重性。同時，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害主要為害根部和莖基部，發(fā)病癥狀隱蔽，早期識別和診斷難度大，一旦發(fā)病出現(xiàn)急性萎蔫，導(dǎo)致全株枯死，來不及進(jìn)行防控，這也說明了提前采取有效的防治措施控制該病害的重要性。國內(nèi)外的一些學(xué)者對其他植物病害通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）的方法進(jìn)行快速檢測[14-17]，建立了快速、準(zhǔn)確檢測病原菌的方法，對病害及時有效控制起到重要的指導(dǎo)作用，關(guān)于黨參根腐病害病原菌的快速檢測和病害診斷有待于進(jìn)一步研究。

鐮孢菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為害最嚴(yán)重的土傳病原物之一，是一種常見的土傳病原菌，具有很強(qiáng)的寄生和腐生能力，同時會產(chǎn)生毒素[18-19]。鐮孢菌的致病性主要通過產(chǎn)生鐮孢菌酸毒素降低寄主植物的抵抗力，影響寄主植物的細(xì)胞代謝；產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶降解寄主植物的細(xì)胞壁防御組織和保護(hù)組織，致使寄主植物細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)釋放；產(chǎn)生一些蛋白物質(zhì)影響病原菌在寄主植物根部定植和萌發(fā)，對寄主植物防衛(wèi)物質(zhì)解毒，使寄主植物失去防御能力[20]。本試驗(yàn)僅明確了黨參根腐病害的發(fā)病癥狀、不同鐮孢菌的種類和優(yōu)勢病原菌尖孢鐮孢菌，但關(guān)于不同鐮孢菌和黨參根腐病的致病機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

黨參病害在高溫多雨、低洼積水、藤蔓繁茂和濕度大的連作地塊發(fā)病嚴(yán)重[21]。在黨參移栽前，盡可能平整地塊。本試驗(yàn)由多種鐮孢菌引起的黨參根腐病可采用綜合方法來解決，其中農(nóng)業(yè)防治最直接的措施就是施用充分腐熟的農(nóng)家肥，遏制病原菌通過帶菌種子和種苗進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。因中藥材的經(jīng)濟(jì)效益驅(qū)動，長期輪作和休耕在我省大多數(shù)種植區(qū)難以實(shí)施，短期輪作可以起到緩解病害的為害，生產(chǎn)中建議黨參和其他禾本科作物輪作，避免連作和重茬。一些蟲害造成的傷口和病原菌復(fù)合侵染加重病害的發(fā)生[22]。在實(shí)際生產(chǎn)中，及時防治地下害蟲，培育和選擇無病蟲感染、無機(jī)械損傷和表皮光滑健康的種苗是減輕發(fā)病的有效措施。國內(nèi)的一些學(xué)者通過化學(xué)藥劑和生物菌劑防治中藥材病害[23-27]。一些殺菌劑前期防效較好，但中后期防效較差，基于黨參對農(nóng)藥殘留要求的特殊性，在種植前通過生物農(nóng)藥進(jìn)行土壤消毒和藥劑浸苗是預(yù)防黨參根腐病的重要措施之一。