基于NF-κB信號(hào)通路的潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)的影響

婁余，肖運(yùn)婷，朱瑩，王燚霈，謝超群

基于NF-κB信號(hào)通路的潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)的影響

婁余1，肖運(yùn)婷1，朱瑩2，王燚霈1，謝超群1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

觀察潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)的影響，從NF-κB信號(hào)通路角度探討其作用機(jī)制。SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、非穴位敷貼組、穴位敷貼組及柳氮磺吡啶（SASP）組。采用番瀉葉、腺嘌呤分階段灌胃結(jié)合外因干預(yù)，并予2,4,6-三硝基苯磺酸與乙醇復(fù)合物灌腸制備UC病證結(jié)合動(dòng)物模型。穴位敷貼組予潰結(jié)寧膏穴位敷貼“足三里”“天樞”“腎俞”“脾俞”“大腸俞”“膈俞”，非穴位敷貼組予潰結(jié)寧膏敷貼臀部肌肉豐厚處，SASP組予SASP溶液灌胃，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，干預(yù)28 d。觀察大鼠一般情況、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分、結(jié)腸組織病理變化；ELISA檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織IκB激酶-α（IKKα）、核因子-κB p65（NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）蛋白表達(dá)。與正常組比較，模型組大鼠CMDI評(píng)分明顯升高（＜0.01），血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著增加（＜0.01，＜0.05），結(jié)腸組織NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01），IκBα蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠CMDI評(píng)分明顯降低（＜0.05，＜0.01），血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量明顯降低（＜0.01，＜0.05），結(jié)腸組織NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01），IκBα蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01，＜0.05）。潰結(jié)寧膏穴位敷貼通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路IKKα、NF-κB p65和IκBα蛋白的表達(dá)，降低血清IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，抑制結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)，進(jìn)而控制UC病情發(fā)展。

潰瘍性結(jié)腸炎；潰結(jié)寧膏；穴位敷貼；NF-κB信號(hào)通路；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-1β；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液膿血便，呈長(zhǎng)期遷延、反復(fù)發(fā)作的慢性過程，難治愈，復(fù)發(fā)率高。目前，臨床上主要采取對(duì)癥治療緩解癥狀，且需長(zhǎng)期服藥。UC發(fā)病機(jī)制涉及多因素，一般認(rèn)為與遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫紊亂、環(huán)境因素等有關(guān)[1-2]，其中腸道免疫功能紊亂是主要原因[3]。NF-κB信號(hào)通路是UC炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，核因子-κB（NF-κB）是通路中重要的調(diào)控因子，可促進(jìn)多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，是治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4-5]。

根據(jù)臨床癥狀，UC屬中醫(yī)學(xué)“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇，《景岳全書》有“凡病里急后重者，病在廣腸最下之處，而其病本則不在廣腸，而在脾腎”。脾主一身之運(yùn)化，腎寓一身之真陽(yáng)，泄瀉日久，脾陽(yáng)不振，累及腎陽(yáng)，不能溫煦脾土，運(yùn)化失常，脾虛濕盛，濕邪壅滯腸絡(luò)，氣血瘀滯，血敗肉腐，內(nèi)潰成瘍，屬本虛標(biāo)實(shí)，即脾腎陽(yáng)虛為本，血瘀為標(biāo)，基本病機(jī)可用“脾腎陽(yáng)虛夾瘀”概括。因此，針對(duì)“虛、瘀”狀態(tài)下UC的病機(jī)，立“溫陽(yáng)化瘀”之法，以達(dá)溫腎暖脾治其本、活血化瘀治其標(biāo)的目的，自制潰結(jié)寧膏。在中醫(yī)辨證和經(jīng)穴-臟腑相關(guān)理論指導(dǎo)下，通過穴位刺激使藥性貫經(jīng)絡(luò)傳至臟腑以治療本病，患者依從性好，操作簡(jiǎn)單方便，療效確切。潰結(jié)寧膏穴位敷貼為本課題組多年的經(jīng)驗(yàn)治法，前期研究發(fā)現(xiàn)，其可通過下調(diào)Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的表達(dá)，抑制NF-κB活化，減輕腸道炎癥反應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，觀察潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜IκB激酶-α（IκB kinase，IKKα）、NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitor-α，IκBα）表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)一步探討潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)UC“虛、瘀”狀態(tài)下結(jié)腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫20～25 ℃，自然晝夜節(jié)律光照，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

潰結(jié)寧膏（炮附子、細(xì)辛、延胡索、赤芍、丁香、芥子、生姜）、無(wú)藥物巴布劑基質(zhì)敷貼（聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇），均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備。柳氮磺吡啶片（SASP），上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09190501。

1.3 主要試劑與儀器

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)P2297；腺嘌呤，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)A8626；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)分別為ml102828、ml1002859、ml037361；NF-κB p65、IKKα及IκBα抗體，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab16502、ab32041、ab32518；β-actin抗體，美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)66009-1-Ig。生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，BioPrep-24），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀動(dòng)力測(cè)試儀器有限公司，H1650R），DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠），多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，MB-530）。

1.4 分組及造模

SD大鼠50只隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（40只）。參照課題組前期方法進(jìn)行模型制備與評(píng)價(jià)[7]。每日給予大鼠番瀉葉、腺嘌呤分階段灌胃，連續(xù)4周。于第29日禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉。在液體石蠟油潤(rùn)滑下，將16號(hào)灌胃針頭輕柔插入距肛門約8 cm處，將TNBS按100 mg/kg（約TNBS原液0.2 mL/100 g）加入50%乙醇（0.25 mL）制成混合試劑，充分混勻后注入大鼠腸腔，結(jié)束后推入0.3 mL空氣，再將灌胃針頭緩慢拔出，輕揉大鼠腹部1 min，捏緊大鼠肛門并提尾倒置2 min后將大鼠平放在鼠籠中，自然清醒后常規(guī)飲食。造模過程中觀察大鼠一般活動(dòng)狀態(tài)，造模結(jié)束后，于造模組隨機(jī)抽取4只、正常組1只處死，取結(jié)腸組織，觀察其形態(tài)學(xué)改變。成模后可見大鼠毛發(fā)稀疏少澤，神態(tài)萎靡，嗜睡懶動(dòng)，飲食明顯減少，小便清長(zhǎng)，大便溏泄且/或伴有黏液膿血便；結(jié)腸組織可見局部潰瘍?cè)?、糜爛、充血、水腫等改變；光學(xué)顯微鏡下可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜層缺損、腺體減少及排列紊亂等病理改變。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、非穴位敷貼組、穴位敷貼組及SASP組，每組9只。

1.5 干預(yù)

取穴參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]，“足三里”位于膝關(guān)節(jié)下側(cè)、腓骨小頭下緣5 mm處，“天樞”位于臍中旁開5 mm，“脾俞”位于第12胸椎棘突下旁開5 mm，“腎俞”位于第2腰椎棘突下旁開5 mm，“大腸俞”位于第4腰椎棘突下旁開5 mm，“膈俞”位于第7胸椎棘突下旁開5 mm。大鼠選穴定位后進(jìn)行備皮，貼藥后予鼠夾固定。正常組和模型組給予巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃，穴位敷貼組給予潰結(jié)寧膏穴位敷貼加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃，非穴位敷貼組給予潰結(jié)寧膏敷貼臀部肌肉豐厚處加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃，SASP組巴布劑基質(zhì)穴位敷貼加SASP溶液（用生理鹽水配成10 mg/mL溶液）50 mg/kg灌胃。造模成功后3 d開始干預(yù)。每日1次，每次2 h，每次貼一側(cè)，左右交替，給藥療程均為28 d。

1.6 標(biāo)本采集

給藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，行腹腔麻醉，下腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。距肛門6～10 cm取腸段，冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，一部分置于4%多聚甲醛中密封避光4 ℃保存，用于HE染色，另一部分置凍存管-80 ℃保存，用于Western blot檢測(cè)。

1.7 一般觀察

實(shí)驗(yàn)期間每日觀察大鼠精神活動(dòng)狀態(tài)、體質(zhì)量、進(jìn)食量、毛發(fā)光澤度、大便性狀及便血情況等。

1.8 大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評(píng)分

采集結(jié)腸組織標(biāo)本，進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分[9]：黏膜無(wú)損傷，0分；黏膜充血、水腫，無(wú)潰瘍，1分；黏膜充血、水腫、輕度糜爛及無(wú)潰瘍，2分；黏膜充血、水腫、中度糜爛及有單個(gè)潰瘍，3分；黏膜充血、水腫、高度糜爛及有多處潰瘍，4分；黏膜充血、水腫、重度糜爛及有＞1 cm潰瘍，5分。

1.9 HE染色

取大鼠部分結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織形態(tài)。

1.10 血清炎癥因子含量檢測(cè)

取大鼠血清，采用ELISA測(cè)定血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后將孔板置于多功能酶標(biāo)儀，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各孔吸光度（OD值）。

1.11 Western blot檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織IκB激酶-α、NF-κB抑制蛋白α、核因子-κB p65蛋白表達(dá)

采用RIPA裂解液提取結(jié)腸組織蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將制備好的樣品和Marker加入上樣孔，電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉。加入IKKα、NF-κB p65及IκBα一抗（1∶20 000、1∶2000、1∶5000）及內(nèi)參β-actin（1∶5000），室溫孵育90 min。PBST緩沖液洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫共同孵育60 min。ECL顯色曝光，采用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

干預(yù)過程中模型組大鼠死亡2只，非穴位敷貼組、穴位敷貼組及SASP組各死亡1只。正常組大鼠飲食、活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，大便成形，肛周未見異常分泌物；模型組大鼠從造模第2周開始直至造模結(jié)束，飲食減少，相繼出現(xiàn)神態(tài)萎靡，嗜睡懶動(dòng)，毛發(fā)稀疏少澤，甚則弓背蜷縮聚堆，小便清長(zhǎng)，大便質(zhì)軟，甚者稀溏，肛周見黏液膿血分泌物，部分大鼠出現(xiàn)腹部脹滿；穴位敷貼組及SASP組大鼠癥狀、體征均有不同程度改善，體質(zhì)量增加，飲食量增加，基本接近正常組；非穴位敷貼組大鼠癥狀、體征、體質(zhì)量等較模型組有所改善，但明顯低于穴位敷貼組和SASP組。

2.2 潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)模型大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評(píng)分的影響

治療結(jié)束后，采集大鼠結(jié)腸組織標(biāo)本進(jìn)行CMDI評(píng)分。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見充血、水腫、糜爛明顯，有多處潰瘍病灶，CMDI評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，穴位敷貼組、SASP組大鼠結(jié)腸黏膜充血、水腫程度明顯減輕，少數(shù)有糜爛及小潰瘍?cè)睿珻MDI評(píng)分明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖1、表1。

2.3 潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列規(guī)整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見水腫、充血、糜爛、潰瘍等情況；模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮部分缺損，腺體減少，且排列紊亂，黏膜水腫、充血明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞減少，形成潰瘍?cè)?；非穴位敷貼組結(jié)腸黏膜缺損，腺體排列紊亂，黏膜水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；穴位敷貼組及SASP組結(jié)腸組織損傷均有改善，黏膜潰瘍減少，腺體結(jié)構(gòu)排列尚規(guī)則，充血、水腫明顯減輕，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.非穴位敷貼組；D.穴位敷貼組；E. SASP組

表1 各組大鼠CMDI評(píng)分比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

注：A.正常組；B.模型組；C.非穴位敷貼組；D.穴位敷貼組；E. SASP組

2.4 潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，穴位敷貼組、SASP組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；與非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表2。

2.5 潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織IκB激酶-α、NF-κB抑制蛋白α、核因子-κB p65表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高，IκBα蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，非穴位敷貼組、穴位敷貼組、SASP組大鼠結(jié)腸組織IKKα和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低，穴位敷貼組、SASP組大鼠結(jié)腸組織IκBα蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；與非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)明顯降低，IκBα蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見圖3、表3。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01；與非穴位敷貼組比較，&＜0.05，&&＜0.01

注：A.正常組；B.模型組；C.穴位敷貼組；D.非穴位敷貼組；E. SASP組

表3 各組大鼠結(jié)腸組織IKKα、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01；與非穴位敷貼組比較，&&＜0.01

3 討論

臨床上UC患者病情遷延難愈、病程長(zhǎng)，常出現(xiàn)不同程度的陽(yáng)虛表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，慢性緩解期UC以脾腎陽(yáng)虛型為主[10]，因陽(yáng)虛失于溫煦，血行滯緩，加之病情遷延難愈，“久病必瘀”，故其病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，即脾腎陽(yáng)虛為本，血瘀為標(biāo)。潰結(jié)寧膏方君以附子溫腎暖脾以散寒凝；臣以細(xì)辛溫脾散寒，丁香溫補(bǔ)脾腎；佐以赤芍散瘀止痛，延胡索活血行氣止痛，寓“行血?jiǎng)t便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”之意；芥子行氣機(jī)、通經(jīng)絡(luò)，長(zhǎng)于治寒疾凝結(jié)之證，本方取其行散之性，助諸藥之性達(dá)病所，為佐藥；生姜溫脾散寒，調(diào)和藥性，為使。諸藥制成膏劑貼敷于穴位表面，共奏溫腎暖脾、活血化瘀之效。課題組前期體外透皮實(shí)驗(yàn)證實(shí)潰結(jié)寧膏透皮效果較好[11]。在經(jīng)穴-臟腑相關(guān)理論指導(dǎo)下，取穴“足三里”“天樞”“腎俞”“膈俞”“脾俞”“大腸俞”進(jìn)行潰結(jié)寧膏敷貼，依據(jù)經(jīng)絡(luò)“聯(lián)系上下，溝通表里”，使藥性貫經(jīng)絡(luò)傳至臟腑，發(fā)揮治療作用。本研究中，模型組大鼠結(jié)腸黏膜糜爛、充血、水腫明顯，有多處潰瘍?cè)?；HE染色結(jié)果顯示，大鼠結(jié)腸黏膜上皮缺損嚴(yán)重，分布有淺表性潰瘍，腺體減少，腺腔不規(guī)則，排列紊亂，黏膜水腫、充血明顯，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)潰結(jié)寧膏穴位敷貼后，大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯減輕，黏膜上皮較完整，糜爛、充血、水腫明顯改善，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明潰結(jié)寧膏穴位敷貼能有效抑制UC炎癥反應(yīng)，修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷。

炎癥是UC發(fā)病過程中的重要病理反應(yīng)，細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的主要參與者，促炎與抗炎因子失衡是導(dǎo)致腸道炎癥的病理基礎(chǔ)[12]。IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的促炎因子，IL-1β由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，炎癥性腸病患者中存在IL-1β高表達(dá)，提示其在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，IL-1β已成為治療全身和局部炎癥性疾病的靶標(biāo)，可通過降低IL-1β活性達(dá)到治療效果[14]。IL-6具有較廣泛的生物學(xué)活性，一方面參與腸黏膜炎癥的激活并起到級(jí)聯(lián)放大作用，另一方面參與腸黏膜免疫應(yīng)答紊亂[15-16]。研究表明，UC大鼠腸黏膜組織IL-6含量明顯增加，并與UC疾病活動(dòng)呈正相關(guān)[17]。TNF-α在UC患者中呈高表達(dá)，且與UC病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量較正常組明顯增加，經(jīng)潰結(jié)寧膏穴位敷貼治療后三者含量明顯減少，提示潰結(jié)寧膏穴位敷貼具有抑制腸道炎癥反應(yīng)、修復(fù)炎癥損傷的確切療效。

NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)重要通路之一，NF-κB作為該通路中的關(guān)鍵因子，其亞基NF-κB p65在UC患者結(jié)腸黏膜中高表達(dá)，并破壞黏膜生理性屏障，導(dǎo)致結(jié)腸通透性增高，促進(jìn)UC病變進(jìn)展[19]。一般情況下，NF-κB在真核生物結(jié)腸上皮細(xì)胞中以p65/p50二聚體形式存在，其中p65主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與IκB結(jié)合形成三聚體復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中[20]。當(dāng)炎癥刺激時(shí)，IKK能使IκB蛋白磷酸化，導(dǎo)致IκB從三聚體中解離出來(lái)，NF-κB二聚體能暴露出核定位序列，迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)移至細(xì)胞核，與核內(nèi)DNA上的特異序列相結(jié)合，可上調(diào)TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)，導(dǎo)致IL-1β、TNF-α等促炎因子釋放增加，進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)，致使腸道黏膜損傷[19，21]。王怡薇等[22]發(fā)現(xiàn)，黃芩湯可能通過抑制NF-κB p65通路活化，下調(diào)一氧化氮、IL-6及TNF-α等表達(dá)，從而達(dá)到治療UC的效果。吳玉泓等[23]研究表明，久瀉靈顆粒可通過降低脾腎陽(yáng)虛型UC大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65基因和蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制結(jié)腸黏膜炎癥、修復(fù)黏膜損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠IKKα、NF-κB p65蛋白高表達(dá)，IκBα蛋白低表達(dá)，潰結(jié)寧膏穴位敷貼治療能顯著下調(diào)IKKα、NF-κB p65蛋白表達(dá)，上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)。提示潰結(jié)寧膏穴位敷貼可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的釋放，從而減輕腸黏膜炎癥，修復(fù)腸黏膜損傷。

綜上，潰結(jié)寧膏穴位敷貼可明顯改善“虛、瘀”狀態(tài)下UC大鼠一般情況及結(jié)腸組織病理?yè)p傷，降低IKKα、NF-κB p65蛋白表達(dá)，升高IκBα蛋白表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的過度激活，糾正免疫炎癥紊亂，從而達(dá)到控制UC病情進(jìn)展和改善癥狀的作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

[1] 王玉芳,歐陽(yáng)欽,胡仁偉,等.炎癥性腸病流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué),2013,18(1)：48-51.

[2] KAPLAN G G, NG S C. Understanding and preventing the global increase of inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2017,152(2)：313-321.

[3] UNGARO R, MEHANDRU S, ALLEN P B, et al. Ulcerative colitis[J]. Lancet,2017,389(10080)：1756-1770.

[4] PEDERSEN J, COSKUN M, SOENDERGAARD C, et al. Inflammatory pathways of importance for management of inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol,2014,20(1)：64-77.

[5] HAYDEN M S, GHOSH S. Shared principles in NF-kappaB signaling[J]. Cell,2008,132(3)：344-362.

[6] 鄭潔,朱瑩,高昂.潰結(jié)寧膏穴位敷貼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(脾腎陽(yáng)虛證)大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2019, 36(10)：1593-1598.

[7] 鄭潔,朱瑩,高昂,等.脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的研制[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2016,24(3)：182-187.

[8] 郭義.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2008.

[9] 王彤,王驍,范煥芳,等.白頭翁湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜及血清TNF-α、IL-6影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,19(2)：32-35.

[10] 李毅,樊新榮,劉力,等.基于因子分析與聚類分析對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)證候規(guī)律的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2017,37(10)：1191-1195.

[11] 朱瑩,王燚霈,張水寒.潰結(jié)寧膏的體外透皮實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)雜志,2013,29(8)：119-120.

[12] 郝彥偉,張怡,周雪雷,等.基于mTOR/p-S6K1探討加味附子理中湯干預(yù)UC大鼠腸黏膜炎癥反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2020, 26(13)：59-65.

[13] LAZARIDIS L D, PISTIKI A, GIAMARELLOS-BOURBOULIS E J, et al. Activation of NLRP3 inflammasome in inflammatory bowel disease：differences between Crohn’s disease and ulcerative colitis[J]. Dig Dis Sci,2017,62(9)：2348-2356.

[14] DINARELLO C A. Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases[J]. Blood,2011,117(14)：3720-3732.

[15] HERMANNS H M, WOHLFAHRT J, MAIS C, et al. Endocytosis of pro-inflammatory cytokine receptors and its relevance for signal transduction[J]. Biol Chem,2016,397(8)：695-708.

[16] NIKOLAUS S, WAETZIG G H, BUTZIN S, et al. Evaluation of interleukin-6 and its soluble receptor components sIL-6R and sgp130 as markers of inflammation in inflammatory bowel diseases[J]. Int J Colorectal Dis,2018,33(7)：927-936.

[17] 徐敏,王鳳儀,趙黨生,等.芍藥湯對(duì)濕熱內(nèi)蘊(yùn)型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TLR4,NF-κB p65和IL-6表達(dá)的調(diào)控作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020,26(14)：53-58.

[18] 張志軍,劉懿,王磊,等.TLR4mAb對(duì)急性期潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影響[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2008,35(2)：176-180.

[19] 黃循銣,王承黨,王瑞幸,等.潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道通透性改變與TNF-α及NF-κB p65的關(guān)系[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2016,32(2)：112-115,193.

[20] ZHANG Q, LENARDO M J, BALTIMORE D. 30 years of NF-κB：A blossoming of relevance to human pathobiology[J]. Cell,2017, 168(1/2)：37-57.

[21] MOLYVDAS A, GEORGOPOULOU U, LAZARIDIS N, et al. The role of the NLRP3 inflammasome and the activation of IL-1β in the pathogenesis of chronic viral hepatic inflammation[J]. Cytokine, 2018,110：389-396.

[22] 王怡薇,張會(huì)會(huì),王彥禮,等.黃芩湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB p65調(diào)控作用研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(1)：21-27.

[23] 吳玉泓,許雅清,李海龍,等.久瀉靈顆粒對(duì)脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TLR4及NF-κB p65表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2016, 24(1)：47-52.

Effects of Acupoint Application ofPlaster on Intervening Inflammatory Response of Colonic Mucosa in Rats with Ulcerative Colitis Based on NF-κB Signaling Pathway

LOU Yu1, XIAO Yunting1, ZHU Ying2, WANG Yipei1, XIE Chaoqun1

To explore the effects of acupoint application ofPlaster on inflammatory reaction of colonic mucosa in rats with ulcerative colitis (UC); To explore the mechanism of action from the perspective of NF-κB signaling pathway.SD rats were randomly divided into normal group, model group, non-acupoint application group, acupoint application group and sulfasalazine (SASP) group. The rat model was established by gavage of the decoction of Folium Sennae and adenine at different stages combined with external intervention as well as enema with the compound of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid and alcohol. The acupoint application group was givenPlaster on acupoint application (). Non-acupoint application group was givenPlaster non-acupoint application (gluteal muscles). SASP group was given intragastric administration of SASP. Normal group and model group were given the equal volume of normal saline, once a day, lasting for 28 d. The general condition, colonic mucosal damage index (CMDI) score and pathological changes of colon were observed; the contents of serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β and IL-6 were detected by ELISA, and the expressions of IKKα, NF-κB p65 and IκBα protein in colon tissues were detected by Western blot.Compared with the normal group, the CMDI score of the model group increased (<0.01), the levels of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α significantly increased (<0.01,<0.05), the expressions of NF-κB p65 and IKKα protein in colon tissue significantly increased (<0.01), and the expression of IκBα protein significantly decreased (<0.01). Compared with the model group, the CMDI score of rats in acupoint application group and SASP group decreased (<0.05,<0.01), the contents of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α significantly decreased (<0.01,<0.05), the expression of NF-κB p65 and IKKα protein in colon tissue significantly decreased (<0.01), and the expression of IκBα protein significantly increased (<0.01,<0.05).Plaster acupoint application can inhibit the inflammation reaction of colonic mucosa, and then control the development of UC by regulating the expressions of IKKα, NF-κB p65 and IκBα proteins in the NF-κB pathway and reducing the contents of IL-1β, IL-6, and TNF-α in serum.

ulcerative colitis;Plaster; acupoint application; NF-κB signaling pathway; TNF-α; IL-6; IL-1β; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)04-0075-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202009275

國(guó)家自然科學(xué)基金（81874466）；中醫(yī)內(nèi)科重大疾病防治研究與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（ZYNK201705）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20190546）

朱瑩，E-mail：zhuying089@126.com

（收稿日期：2020-09-18）

（修回日期：2020-10-27；編輯：華強(qiáng)）