黑曲霉兩步法與化學(xué)氧化聯(lián)合浸出花崗巖鈾礦石

祖媛媛，李廣悅,*，孫 靜，李芳艷，王永東

1.南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué) 極貧鈾資源綠色開(kāi)發(fā)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001

隨著高品位鈾礦資源的逐漸枯竭，中低品位鈾礦資源的高效開(kāi)發(fā)利用已成為目前亟需解決的一項(xiàng)重要課題。然而，傳統(tǒng)的浸出方法存在成本高、環(huán)境污染大等缺點(diǎn)，無(wú)法高效回收這些資源。生物浸出方法因其具有成本低、能耗少、生態(tài)環(huán)境危害小、工藝流程簡(jiǎn)單、資源利用率高等特點(diǎn)，而被廣泛關(guān)注。其中，氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans)等細(xì)菌浸出方法已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[1]。

真菌浸出是一種新型的生物浸礦方法，其主要利用真菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸與礦物中的金屬離子形成絡(luò)合物，將金屬溶解出來(lái)[2-3]。與細(xì)菌相比，真菌具有對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求低、生長(zhǎng)速率快、生物量大等優(yōu)勢(shì)。黑曲霉(Aspergillusniger,A.niger)是常用的浸礦真菌，具有適應(yīng)性強(qiáng)、代謝活性高、有機(jī)酸產(chǎn)量大等特點(diǎn)，被眾多學(xué)者用于鈾、銅、錳等金屬的浸出研究。Amin等[4]用從礦石中分離的黑曲霉等八種真菌開(kāi)展含鈾沉積巖浸鈾研究，其中黑曲霉和黃曲霉的鈾浸出率最高。Ghazala等[5]開(kāi)展了黑曲霉發(fā)酵液中提取的檸檬酸浸出磷礦中鈾的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)固液比為1∶20時(shí)，鈾浸出率可達(dá)91.1%。Mehta等[6]用黑曲霉從印度洋錳結(jié)核中浸出銅、鎳、錳和鈷，四種金屬的浸出率分別為97%(Cu)、98%(Ni)、86%(Co)、91%(Mn)。Chaerun等[7]用黑曲霉發(fā)酵液浸出低品位鎳褐鐵礦和腐泥礦，結(jié)果表明：鎳褐鐵礦中金屬鎳的浸出率達(dá)88.9%，腐泥礦中金屬鎳的浸出率為84.9%。Vakilchap等[8]開(kāi)展了黑曲霉浸出拜耳法赤泥中的有價(jià)金屬研究，鋁、鈦、鐵的浸出率分別為69.8%、60%、25.4%。Qu等[9]采用黑曲霉浸出赤泥中的重金屬，發(fā)現(xiàn)在高礦漿濃度條件下，一步浸出法會(huì)明顯抑制黑曲霉產(chǎn)生有機(jī)酸的活性，而兩步浸出法更有利于黑曲霉產(chǎn)酸。

花崗巖型鈾礦是我國(guó)重要的一類(lèi)鈾礦資源，占已探明鈾儲(chǔ)量的28%左右[10]?；◢弾r鈾礦中的主要鈾礦物為瀝青鈾礦，U(Ⅳ)所占比例高。黑曲霉浸鈾過(guò)程是通過(guò)黑曲霉代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸的酸化和絡(luò)合作用，將固相中的鈾變?yōu)橐合嘀锌扇艿慕j(luò)合物。但由于U(Ⅳ)的溶解度低，因此，需將U(Ⅳ)氧化為U(Ⅵ)。

目前，對(duì)真菌浸礦方式的研究較多，主要包括以下三種[11]：(1)一步浸出法，即將真菌和礦石同時(shí)培養(yǎng)；(2)兩步浸出法，即先將真菌進(jìn)行一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，再將礦石加入進(jìn)行浸出；(3)發(fā)酵液浸出法，即先將真菌發(fā)酵培養(yǎng)，然后用其發(fā)酵液進(jìn)行浸礦。但將黑曲霉兩步法與化學(xué)氧化聯(lián)合浸鈾的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。為此，本工作擬通過(guò)開(kāi)展搖瓶實(shí)驗(yàn)，研究黑曲霉預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸出時(shí)間和不同氧化劑及其用量對(duì)花崗巖鈾礦石浸出的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

VB-40全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，北京萊比信科技發(fā)展有限公司；SPH-2112F全溫度恒溫培養(yǎng)振動(dòng)器、BPMJ-150F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Research移液槍?zhuān)聡?guó)Eppendorf公司；AL104電子天平，精度萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)，精度百分之一，上海雷磁儀器廠；D/max 2500X射線衍射儀，日本理學(xué)公司。

實(shí)驗(yàn)所用黑曲霉菌株(A.niger)由南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室分離純化，并置于-80 ℃冰箱中保藏。黑曲霉的復(fù)壯和孢子的制備采用PDA固體培養(yǎng)基，黑曲霉浸鈾采用不添加瓊脂粉的PDA液體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min。

花崗巖鈾礦石取自于廣東某鈾礦山。原礦通過(guò)破碎研磨烘干后，過(guò)200目篩得到粒徑小于74 μm的礦樣。礦樣的X射線熒光光譜分析結(jié)果列入表1。由表1可知，礦石中主要含Si、Ca、Al等成分，鈾的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22%，w(U(Ⅳ))/w(U(Ⅵ))=2.67∶1，U(Ⅳ)所占比例較高。

表1 礦樣的主要化學(xué)成分

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)孢子懸液的制備

將冷凍保藏的黑曲霉菌種采用PDA液體培養(yǎng)基活化后，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96 h至孢子成熟，用無(wú)菌蒸餾水沖洗PDA平板表面成熟的孢子制得孢子懸液，經(jīng)0.45 μm微孔濾頭過(guò)濾后，滴入改良紐鮑爾計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度為每100 mL 107個(gè)孢子，用于黑曲霉浸鈾實(shí)驗(yàn)。

(2)黑曲霉兩步法浸出實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取2.000 0 g礦樣，用稱(chēng)量紙包好，于121 ℃高壓滅菌30 min備用。將制備好的無(wú)菌PDA液體培養(yǎng)基倒入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL。然后，接種黑曲霉孢子懸液1 mL，在30 ℃、150 r/min的條件下進(jìn)行不加礦石的恒溫振蕩預(yù)培養(yǎng)。為研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉浸鈾的影響，設(shè)計(jì)不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)組，每組的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、36、48、60、72 h。當(dāng)每組達(dá)到預(yù)培養(yǎng)時(shí)間后，加入2.000 0 g已滅菌礦樣，再浸出5 d。在浸出過(guò)程中，每天監(jiān)測(cè)浸出液的pH值。浸出結(jié)束后，固液分離收集尾渣和浸出液，用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測(cè)尾渣鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算鈾浸出率，確定黑曲霉的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值，下同。

在最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上研究浸出時(shí)間對(duì)黑曲霉浸鈾的影響，浸出時(shí)間分別為24、48、72、96、120、144、168 h。在浸出過(guò)程中，每天監(jiān)測(cè)浸出液的pH值。當(dāng)每組達(dá)到浸出時(shí)間后，固液分離收集尾渣和浸出液，用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測(cè)尾渣的鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算鈾浸出率，確定最佳浸出時(shí)間。

(3)氧化劑強(qiáng)化浸出實(shí)驗(yàn)

在黑曲霉最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間基礎(chǔ)上，同時(shí)加入滅菌礦樣和氧化劑，浸出時(shí)間為上述確定的最佳浸出時(shí)間。選取NaClO3、MnO2、H2O2為氧化劑。MnO2加入量分別為1.5%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(與礦石質(zhì)量比)，NaClO3加入量分別為1.5%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%(與礦石質(zhì)量比)，H2O2加入量分別為1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%(與培養(yǎng)基體積比)，浸出結(jié)束后用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法檢測(cè)尾渣的鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w(U))，計(jì)算鈾浸出率。

(4)尾渣鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定及鈾浸出率計(jì)算

將烘干至恒重的尾渣研磨至粒徑小于74 μm，稱(chēng)取0.3～0.5 g尾渣置于100 mL燒杯中，加入5 mL高氯酸加熱蒸干，消除有機(jī)質(zhì)的干擾。其后用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法對(duì)尾渣中的鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算尾渣鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)和鈾浸出率(η)。

(1)

(2)

式中：ρ，釩酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)鈾的滴定度，g/L；V，滴定消耗的釩酸銨溶液體積，mL；m，尾渣的樣品質(zhì)量，g；m1，尾渣總質(zhì)量，g；w0(U)，原礦鈾質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m2，原礦總質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾的影響

黑曲霉的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(t)對(duì)鈾浸出的影響示于圖1。由圖1可知：隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鈾浸出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，預(yù)培養(yǎng)36 h時(shí)，鈾浸出率達(dá)到最大值55.29%。鈾浸出率與黑曲霉預(yù)培養(yǎng)時(shí)間之間的關(guān)系和黑曲霉的生物活性以及生物量有關(guān)。由黑曲霉的生長(zhǎng)曲線(圖2)可知，0～30 h為其生長(zhǎng)延滯期。在此期間，黑曲霉預(yù)培養(yǎng)12 h時(shí)鈾浸出率為48.78%，預(yù)培養(yǎng)24 h為51.50%。這是由于微生物接種到一個(gè)新環(huán)境，會(huì)暫時(shí)缺乏分解催化底物的酶或者缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物；同時(shí)對(duì)外界環(huán)境如溫度、溶液pH值等較為敏感，因而細(xì)胞分裂緩慢，黑曲霉生長(zhǎng)速率幾乎為零，導(dǎo)致生物活性低，生物量小。在此階段黑曲霉干重僅為0.00～0.10 g，濕重僅為0.00～1.50 g。另一方面，在延滯期加入礦石，增強(qiáng)了礦石與孢子間的剪切或者沖撞作用，使得黑曲霉延滯期延長(zhǎng)。

圖1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾的影響

圖2 黑曲霉的純培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

30～72 h為指數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期的黑曲霉已經(jīng)適應(yīng)了新環(huán)境，細(xì)胞開(kāi)始以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，體系中的代謝產(chǎn)物有機(jī)酸不斷積累，孢子凝聚成多個(gè)直徑為2～3 mm的菌絲球[12]。此階段黑曲霉生物活性最高，生物量快速增大，黑曲霉干重達(dá)到0.56 g，濕重達(dá)到12.84 g，預(yù)培養(yǎng)36 h時(shí)鈾浸出率達(dá)到最大值55.29%。

黑曲霉預(yù)培養(yǎng)72 h后生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，在此階段黑曲霉生物量已經(jīng)達(dá)到平衡，生物活性逐漸降低，不利于后續(xù)浸礦。同時(shí)，黑曲霉菌絲球直徑可達(dá)4～5 mm，此時(shí)的黑曲霉菌絲對(duì)鈾存在較強(qiáng)的吸附作用[13]，黑曲霉預(yù)培養(yǎng)72 h時(shí)鈾浸出率僅為45.00%，數(shù)值明顯下降。

2.2 浸出時(shí)間對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾的影響

選擇36 h的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，研究浸出時(shí)間(t′)對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾的影響。浸出液最終pH和鈾浸出率隨浸出時(shí)間變化示于圖3。由圖3可知，浸出液最終的pH值隨著浸出時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升，浸出時(shí)間為168 h時(shí)，pH上升至3.71。pH值的上升一方面是由于隨著浸出時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，黑曲霉生長(zhǎng)速率減緩，導(dǎo)致有機(jī)酸分泌量減少[14]；同時(shí)，隨著浸出時(shí)間延長(zhǎng)，黑曲霉產(chǎn)生的孢內(nèi)堿性代謝產(chǎn)物會(huì)因菌絲球的裂解和菌體細(xì)胞壁的溶解釋放到孢外[15]；此外，黑曲霉生長(zhǎng)進(jìn)入衰減期后，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏會(huì)使其利用自身代謝產(chǎn)物，消耗有機(jī)酸[16]。

t=36 h

鈾浸出率隨浸出時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。浸出時(shí)間小于72 h時(shí)，黑曲霉代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸不斷積累，充足的有機(jī)酸有利于鈾的浸出，第72 h時(shí)鈾浸出率達(dá)到最大值59.34%。浸出時(shí)間大于72 h后，鈾浸出率開(kāi)始下降，浸出168 h時(shí)降至47.45%。鈾浸出率下降是由于黑曲霉菌絲對(duì)鈾的吸附所致。已有研究[6，17-18]證實(shí)，真菌對(duì)鈾、銅、鎳等金屬離子具有很強(qiáng)的吸附能力。Hefnawy等[17]開(kāi)展真菌浸鈾時(shí)發(fā)現(xiàn)，土曲霉和小刺青霉對(duì)鈾的吸附能力隨著礦漿濃度的增加而提高。Mehta等[6]用黑曲霉浸出印度洋錳結(jié)核時(shí)，黑曲霉對(duì)銅、鎳、鈷、錳均有吸附作用。Mukhopadhyay等[18]在利用預(yù)培養(yǎng)的黑曲霉處理銅的生物吸附研究中，證實(shí)了金屬離子和真菌細(xì)胞壁上的羧基、硫醇、羥基、羰基等官能團(tuán)反應(yīng)發(fā)生吸附作用。

2.3 不同氧化劑及其用量對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾的影響

不同氧化劑及其用量對(duì)鈾浸出率的影響示于圖4。由圖4可知：三種氧化劑對(duì)鈾浸出率均有不同程度的提高，其中MnO2的效果最為顯著。MnO2氧化U4+的原理是其使溶液中的Fe2+氧化成Fe3+，F(xiàn)e3+再將難溶的U(Ⅳ)氧化為易溶的U(Ⅵ)，從而提高鈾浸出率[19]。當(dāng)MnO2加入量為2.5%時(shí)，鈾浸出率最高，為74.09%，比空白組(不加氧化劑時(shí)鈾浸出率為59.34%)提高了14.8%。NaClO3和H2O2的氧化效果均不及MnO2，最高鈾浸出率分別僅為64.77%和64.38%。雖然NaClO3和H2O2均為強(qiáng)氧化劑，但強(qiáng)氧化性會(huì)破壞微生物外層保護(hù)結(jié)構(gòu)，改變保護(hù)層通透性，從而引起細(xì)胞滲透壓改變，破壞微生物體內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，抑制真菌的生長(zhǎng)[20]，因而降低了生物活性。

t=36 h，t′=72 h

MnO2的加入量對(duì)鈾的浸出有著顯著影響，鈾浸出率隨著MnO2的加入呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)加入1.5%(與礦石質(zhì)量比，下同)的MnO2時(shí)，鈾浸出率為65.04%，加入2.5%的MnO2時(shí)，鈾浸出率升至74.09%，而隨著MnO2加入量的繼續(xù)增加，鈾浸出率顯著下降。錳元素是真菌細(xì)胞壁合成、生成孢子和次生代謝產(chǎn)物所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元[7]，少量的錳能夠促進(jìn)真菌代謝，產(chǎn)生有機(jī)酸[21]。但是過(guò)量的MnO2卻不利于浸出，這主要是因?yàn)镸nO2本身是鈾的良好吸附劑[22]，少量添加有助于破壞脈石礦物的結(jié)構(gòu)使礦物暴露，而過(guò)量添加會(huì)導(dǎo)致已浸出的鈾再次吸附到MnO2表面，造成鈾浸出率降低。同時(shí)體系中過(guò)量的金屬錳對(duì)真菌有一定的毒害作用[23]。

3 結(jié) 論

開(kāi)展了黑曲霉兩步法和化學(xué)氧化聯(lián)合浸出花崗巖鈾礦石的研究，結(jié)果表明該法可提高鈾浸出率。黑曲霉的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)兩步法浸鈾效果有顯著影響，黑曲霉預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)鈾浸出率最高，延長(zhǎng)或者縮短預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，均不利于鈾的浸出。浸出時(shí)間對(duì)黑曲霉兩步法浸鈾也有明顯影響，采用預(yù)培養(yǎng)36 h的黑曲霉浸出72 h，鈾浸出率最高為59.34%。在此基礎(chǔ)上，添加NaClO3、MnO2和H2O2等氧化劑均可提高鈾浸出率。其中加入2.5%的MnO2時(shí)浸鈾效果最佳，鈾浸出率可達(dá)74.09%，與未加氧化劑相比，鈾浸出率提高了14.8%。

盡管真菌浸礦是一種具有良好發(fā)展前景的生物浸礦方法，但目前仍處于實(shí)驗(yàn)探索階段，投入工業(yè)應(yīng)用還存在一定距離。因此，需在以下方面進(jìn)一步研究：開(kāi)展優(yōu)良浸礦菌種的選育工作，選育出高產(chǎn)酸且具有耐受高礦漿濃度和金屬毒性的菌株；開(kāi)展真菌浸礦的機(jī)理研究，尤其是真菌產(chǎn)有機(jī)酸含量及其配比對(duì)礦物浸出的影響；尋求來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的培養(yǎng)基原料，降低菌種培養(yǎng)和浸礦成本。