薏苡仁提取物經(jīng)PDGFB/PDGFRβ信號(hào)通路對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

王鵬，何健民，王軍，高維岳

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占口腔癌的90%，由于局部侵襲性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高趨勢(shì)，其5年生存率約為60%[1-2]。已有研究表明，血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)及其受體(PDGFR)之間的相互作用是癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)鍵[3]。血小板源性生長(zhǎng)因子B(PDGFB)在所有PDGF亞型中親和力最高，與血小板源性生長(zhǎng)因子受體β(PDGFRβ)相互作用誘導(dǎo)其磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，PI3K信號(hào)通路參與了許多細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動(dòng)和血管生成，提示PDGFB/PDGFRβ信號(hào)通路可能是一個(gè)治療靶點(diǎn)[4]。伊馬替尼是PDGFRβ的抑制劑，在臨床相關(guān)濃度(IC50<1 μmol/L)下以PDGFRβ特異性方式抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但由于其毒性和不良反應(yīng)較多，尋找低毒性藥物成為OSCC治療的重點(diǎn)[5]。薏苡仁油、薏苡仁多糖、薏苡仁油多肽等為薏苡仁主要活性成分，已被證明具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種作用，但其對(duì)OSCC的作用研究較少[6]?；诖?，現(xiàn)探討薏苡仁提取物(ESC)通過(guò)PDGFB/PDGFRβ信號(hào)通路對(duì)人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在的機(jī)制，為OSCC的臨床治療提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心，批號(hào) CM-1250)。(2)藥物與試劑： ESC(蘇州甫路生物科技有限公司),甲磺酸伊馬替尼(長(zhǎng)沙嘉禎生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、超級(jí)胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司),四噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Amresco公司),結(jié)晶紫染液、聚偏氟乙烯膜、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。(3)儀器設(shè)備： Thermo Revco Elite Ⅱ型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；3422型24孔Transwell小室(美國(guó)Corning公司),MA100N型顯微鏡(日本尼康公司),Coleparmer型垂直電泳儀(上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),GelDoc IT TS2型凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年6—8月在甘肅省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ESC低劑量組、ESC高劑量組和伊馬替尼組。對(duì)照組：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；在對(duì)照組培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入不同濃度相應(yīng)藥物[7-8]，ESC低劑量組加入ESC 10 μmol/L，ESC高劑量組加入ESC 20 μmol/L，伊馬替尼組加入伊馬替尼10 μmol/L，均培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率：將CAL27細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中(200 μl/孔)，待細(xì)胞融合后，按以上方法給予ESC和伊馬替尼干預(yù)24 h，加入MTT(20 μl/孔)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；96孔板中(200 μl/孔)只加培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。用酶標(biāo)儀在630 nm處測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.2 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)CAL27細(xì)胞遷移能力：將CAL27細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板中(2 ml/孔)，待細(xì)胞融合，用100 μl滅菌槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，并給予ESC和伊馬替尼干預(yù)24 h后，顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測(cè)量0 h和24 h時(shí)劃痕寬度，遷移能力=0 h時(shí)劃痕寬度-24 h時(shí)劃痕寬度。

1.3.3 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力：將CAL27細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種在24孔Transwell小室中(0.5 ml/孔)，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并給予ESC和伊馬替尼干預(yù)24 h，取出小室，用4%甲醛固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)紫色染色的穿膜細(xì)胞。

1.3.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平：將CAL27細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板中(2 ml/孔)，待細(xì)胞融合，給予ESC和伊馬替尼干預(yù)24 h后收獲細(xì)胞，離心棄上清，余液根據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提試劑，裂解2 h；進(jìn)行電泳(每孔上樣量為20 μg)，將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與PDGFB(1∶250)、PDGFRβ(1∶200)、p-PDGFRβ(1∶500)、PI3K(1∶300)、Akt(1∶200)、p-Akt(1∶300)和β-actin(1∶1 000)抗體進(jìn)行孵育，4℃過(guò)夜，用TBST緩沖液對(duì)膜進(jìn)行兩次沖洗，將二抗(1∶5 000)在室溫下孵育30 min。進(jìn)行顯色，采集圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組CAL27細(xì)胞增殖、遷移能力和侵襲能力比較 與對(duì)照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、高劑量組CAL27細(xì)胞增殖率、遷移能力和細(xì)胞侵襲數(shù)均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

2.2 各組CAL27細(xì)胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、ESC高劑量組PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

表1 各組CAL27細(xì)胞增殖、遷移能力和侵襲數(shù)比較

圖2 各組CAL27細(xì)胞遷移能力比較

圖3 各組CAL27細(xì)胞侵襲力比較(結(jié)晶紫染色，×200)

表2 各組CAL27細(xì)胞PDGFB、PDGFRβ和p-PDGFRβ蛋白表達(dá)比較

注：A.對(duì)照組；B.伊馬替尼組；C.ESC低劑量組；D.ESC高劑量組

2.3 各組CAL27細(xì)胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)比較 4組CAL27細(xì)胞Akt蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，伊馬替尼組及ESC低劑量組、ESC高劑量組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且伊馬替尼組

表3 各組CAL27細(xì)胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)比較

注：A.對(duì)照組；B.伊馬替尼組；C.ESC低劑量組；D.ESC高劑量組

3 討 論

OSCC是一種發(fā)病率較高的疾病，大多數(shù)患者由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡。因此，迫切需要找到能有效抑制OSCC增殖和遷移的藥物。ESC是從薏苡仁中提取的天然物質(zhì)，其成品制劑(康萊特注射液)已用于臨床腫瘤方面的治療[9-10]，但其涉及的潛在信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，ESC通過(guò)抑制PDGFB的表達(dá)，阻斷PDGFRβ的磷酸化并隨后抑制PDGFRβ介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)抑制CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此，PDGFB/PDGFRβ信號(hào)通路可能是ESC治療OSCC的靶點(diǎn)，可用于干預(yù)OSCC中異常細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

PDGF是體外平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的主要促分裂原，包含A、B、C和D等4個(gè)多肽，以二硫鍵的形式連接成同二聚體或異二聚體[血小板源性生長(zhǎng)因子A(PDGFA)、PDGFB、PDGFC、PDGFD或PDGFAB]，與2個(gè)PDGF結(jié)合親和力不同的受體血小板源性生長(zhǎng)因子受體α(PDGFRα)和PDGFRβ相結(jié)合[11]。研究表明，PDGFB和PDGFRβ之間的相互作用是細(xì)胞增殖和遷移及功能性脈管系統(tǒng)發(fā)展的關(guān)鍵[12]。PDGFB已被廣泛證明有助于人類和動(dòng)物模型在血管損傷后的血管修復(fù)/重塑。如在球囊損傷后，大鼠頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中PDGFB的表達(dá)上調(diào)，以刺激肌細(xì)胞的增殖和遷移[13]。另一方面，已證明抑制PDGFB信號(hào)可減少血管成形術(shù)后的血管修復(fù)/重塑[14]。PDGFB和PDGFRβ在多種人類上皮癌的自分泌刺激腫瘤生長(zhǎng)及旁分泌刺激腫瘤相關(guān)的血管生成中也起著作用[15-17]。如在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，腫瘤細(xì)胞中PDGFB的水平與腫瘤的分級(jí)相關(guān)。已經(jīng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)中觀察到PDGFRβ的高表達(dá)水平[18]。研究顯示，PDGFB主要在OSCC組織的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，表明通過(guò)PDGF-PDGFRβ募集成纖維細(xì)胞的旁分泌途徑[19]。一些研究表明，PI3K/Akt是經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其激活可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和腫瘤轉(zhuǎn)移[20-22]。PDGFB高水平導(dǎo)致PDGFRβ磷酸化后，PDGFRβ募集PI3K、磷脂酶Cγ1和Src家族激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶(SHP-2)等[23]。PDGFB通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)激活β胰腺細(xì)胞中的細(xì)胞周期D1進(jìn)程，而通過(guò)Akt激活平滑肌中的細(xì)胞周期[24]。PI3K/Akt途徑在細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中的作用通常與其下游靶標(biāo)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)分子結(jié)合。細(xì)胞周期蛋白D1調(diào)節(jié)劑如Akt和mTOR的水平變化在癌癥中也很常見(jiàn)，并且正在成為重要的治療靶點(diǎn)[25]。在內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)中可檢測(cè)到高水平的PDGFRβ，并且在不存在Akt信號(hào)傳導(dǎo)的情況下進(jìn)一步誘導(dǎo)PDGFRβ[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，ESC能抑制PI3K/Akt途徑的激活，發(fā)揮腫瘤抑制作用。因此，預(yù)測(cè)ESC對(duì)OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用是通過(guò)滅活PDGFB /PDGFRβ/PI3K/Akt軸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，ESC可抑制CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制PDGFB/PDGFRβ信號(hào)通路的激活有關(guān)，為OSCC的分子靶向治療提供了理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王鵬：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；何健民：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王軍：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；高維岳：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析