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    不同氨基酸對泰萬菌素發(fā)酵影響的研究

    2021-04-19 11:33:12石彥鵬
    中國獸藥雜志 2021年1期
    關鍵詞:亮氨酸甘氨酸色氨酸

    劉 楊,張 萍,石彥鵬,牛 春

    (寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術中心,銀川 寧夏 750101)

    泰萬菌素又稱乙酰異戊酰泰樂菌素,是由英國伊科動物保健品有限公司研發(fā)的新型大環(huán)內酯類抗生素。2004年9月9日經(jīng)歐盟批準用于預防和治療由豬肺炎支原體引起的豬氣喘病、由豬痢疾短螺旋體引起的豬痢疾、由胞內勞森氏菌引起的豬增生性腸炎和由雞毒支原體引起的雞支氣管感染[1];2012年7月6日經(jīng)由FDA批準用于預防由胞內勞森氏菌引起的豬增生性腸炎[2]。目前國內已批準酒石酸泰萬菌素預混劑和可溶性粉用于預防和治療豬、雞支原體感染和豬血痢短螺旋體以及其他敏感細菌感染[3]。具有低毒、高效、低殘留等優(yōu)點,并不產(chǎn)生大環(huán)內酯類抗生素之間的交叉感染,是一類較好的治療呼吸道和消化道感染的大環(huán)內酯類抗生素[3]。該產(chǎn)品目前尚屬國際專利保護期,該專利屬于日本美露香公司,2002年英國依科公司買斷?,F(xiàn)英國依科公司委托山東魯抗委托加工。

    抗生素發(fā)酵單位是標志生產(chǎn)水平的重要指標,研究表明,在泰萬菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入氨基酸對發(fā)酵轉化率和發(fā)酵單位都具有顯著影響[3-5]。為此,本研究對泰萬菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中的氨基酸種類進行了研究,獲得對其發(fā)酵過程影響最大的氨基酸為亮氨酸,賴氨酸和甘氨酸。在此基礎上用正交試驗設計對氨基酸比例進行了優(yōu)化,明顯提高了泰萬菌素的轉化率。

    1 材料與方法

    1.1 菌種 耐熱鏈霉菌16-926 菌種由本公司實驗室保藏。

    1.2 原材料 葡萄糖(天津市凱通化學試劑有限公司);玉米漿(華北制藥康欣有限公司);胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司);可溶性淀粉(國藥集團化學試劑有限公司);棉籽餅粉(大荔偉恒生物科技有限公司);玉米蛋白粉(內蒙阜豐生物科技有限公);聚醚消沫劑(宜新市江山生物科技有限公司);亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、甘氨酸(天津市光復精細化工研究所)。

    1.3 儀器設備 Waters 600高效液相色譜儀(美國Waters);UV-1800紫外分光光度計(日本島津);TDL-5-A型臺式離心機(上海安亭科技有限公司);BSA2202S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);PHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司);SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);CX31型顯微鏡(日本奧林巴斯光學工業(yè)株式會社)。

    1.4 菌種培養(yǎng)基[6]斜面培養(yǎng)基:胰胨豆湯培養(yǎng)基:胰胨豆湯粉30 g,蒸餾水1000 mL。

    種子瓶培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,大豆粉20 g,磷酸氫二鉀0.5 g,七水硫酸鎂 0.5 g,Yeast extract 1.0 g。

    發(fā)酵瓶培養(yǎng)基:可溶性淀粉60 g,大豆粉20 g,酵母粉 4 g,七水硫酸鎂 5 g,棉籽粉7 g,Yeast extract 1.0 g。

    1.5 方法

    1.5.1 氨基酸的選擇

    1.5.1.1 單因素

    表1 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的單因素水平表

    1.5.1.2 多因素

    表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的組合水平表

    1.5.1.3 氨基酸比例

    表3 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的不同比例水平表

    1.5.2 發(fā)酵瓶的培養(yǎng) 用無菌的不銹鋼鏟在無菌條件下鏟取1.5~2 cm2左右的菌絲體接種于種子瓶,置溫度29 ℃,濕度30~50%,轉速為220 r/min的搖瓶機上振蕩培養(yǎng) 48 h,補入底物繼續(xù)轉速為220 r/min的搖瓶機上振蕩培養(yǎng)144 h發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.5.3 發(fā)酵瓶T2i5含量測定方法 稱取發(fā)酵液1 mL溶于無水甲醇溶液5 mL,超聲振蕩器振蕩2~3 min,充分混勻后用0.22 μm有機濾膜過濾后備用。高效液相色譜條件 Agilent Extend-C 18色譜柱,柱溫:40 ℃。流動相:A相為0.1%甲醇水溶液,B相為乙腈;流速為0.4 mL/min。進樣體積為5 μL[7]。

    1.5.4 核酸檢測方法 稱取發(fā)酵液2 mL于10 mL離心管中高速離心機離心,棄去上清液,加入10%三氯乙酸溶液旋渦振蕩1~2 min,高速離心機離心,棄去上清液,加入5%三氯乙酸溶液旋渦振蕩1~2 min,沸水浴30 min,冷卻后高速離心機離心,取上清液加入純化水中充分混搖,紫外分光光度計290 nm處比色。

    2 結果與分析

    2.1 不同氨基酸(單因素)對發(fā)酵過程的影響

    由圖1可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補入亮氨酸或甘氨酸PH值在工藝范圍之內,賴氨酸與色氨酸的PH值或高于工藝范圍、或低于工藝范圍。

    圖1 不同氨基酸(單因素)對發(fā)酵培養(yǎng)基中PH值的影響

    圖2 不同氨基酸(單因素)對發(fā)酵培養(yǎng)基中核酸的影響

    由圖2可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補入亮氨酸或甘氨酸核酸含量明顯大于賴氨酸與色氨酸。

    圖3 不同氨基酸(單因素)對發(fā)酵過程中T2i5含量的影響

    由圖3可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補入亮氨酸或甘氨酸T2i5含量明顯大于賴氨酸與色氨酸。

    2.2 不同氨基酸(多因素)對發(fā)酵過程的影響

    表4 不同氨基酸(多因素)對發(fā)酵過程中的影響

    由表4可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補入亮氨酸、色氨酸和甘氨酸在PH值、核酸含量和T2i5含量方面明顯優(yōu)于其他組合,對其比例再次進行正交實驗。

    2.3 氨基酸正交試驗設計 對氨基酸作了四因素三水平(L934)的正交實驗設計其它不變,其試驗設計和結果如表5~表6。

    表5 搖瓶發(fā)酵正交結果

    表6 正交實驗結果方差分析

    從表5、表6可以看出,4號實驗搖瓶效價最高,平均達到16980 μ/mL,再通過直觀分析和方差分析發(fā)現(xiàn),亮氨酸對搖瓶效價的影響比較大,為主要影響因子。根據(jù)結果選4號配方和A0.2B0.2C0D0.1配方作進一步驗證,同時用原配方作為對照,驗證結果如表7。

    表7 與原配方對比結果

    3 結果與討論

    大環(huán)內酯類抗生素內酯環(huán)的形成需要乙酸、丙酸和丁酸作為前體物質,而這些物質來源于三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝等途徑。主要考察了亮氨酸、賴氨酸、色氨酸和甘氨酸作為泰萬菌素生物合成前體物質對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)表明亮氨酸、賴氨酸、甘氨酸對泰萬菌素發(fā)酵的轉化率和發(fā)酵單位具有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn),單一加入亮氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值一直維持在工藝范圍之內,核酸含量和T2i5含量均為最高;單一加入賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值最低超過工藝范圍,核酸含量和T2i5含量均為最低;單一加入色氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值最高超過工藝范圍,進而影響核酸含量和T2i5含量只高于賴氨酸;單一加入甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值在工藝范圍之內,核酸含量和T2i5含量均稍低于亮氨酸,而高于色氨酸和賴氨酸。因此說明氨基酸單因素因子中亮氨酸、色氨酸、甘氨酸起顯著作用。

    由于考慮到不同氨基酸種類之間對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響,再次對發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸種類進行組合實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中同時加入亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三種氨基酸的PH值、核酸含量和T2i5含量最優(yōu),同時對亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三種氨基酸進行了正交實驗優(yōu)化出其最優(yōu)比例為亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%。因此確定亮氨酸、色氨酸、甘氨酸為泰萬菌素發(fā)酵影響顯著因子。在原培養(yǎng)基配方中按照亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%比例加入三種氨基酸,使得搖瓶效價從14000 μ/mL提高到18000 μ/mL,效價提高了28.5%

    結果表明亮氨酸、色氨酸、甘氨酸加入到發(fā)酵培養(yǎng)基對泰萬菌素發(fā)酵轉化率影響顯著。目前世界范圍內氨基酸種類具有36種,實驗只對實驗室常見的幾種氨基酸進行了試驗,不同氨基酸對泰萬菌素發(fā)酵影響還可以進一步擴大研究范圍。

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