2型糖尿病腎病實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物的研究進(jìn)展

楊雪嬌，劉子杰

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，云南 昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032)

糖尿病已成為全球性公共衛(wèi)生問題，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)2013年的數(shù)據(jù)，全球糖尿病患病人數(shù)為3.82億，25年內(nèi)將上升到5.92億，其中約90%是2型糖尿病[1]。我國(guó)是糖尿病的第一大國(guó)，成年人中糖尿病的發(fā)病率為11.6%[2-3]。糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥是糖尿病腎病，也是終末期腎病(ESRD)的主要病因，致死率較高[4]，早期診斷將有機(jī)會(huì)延緩甚至逆轉(zhuǎn)病情，因此發(fā)現(xiàn)早期診斷標(biāo)志物顯得尤為重要。本文主要闡述目前2型糖尿病腎病實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的局限性及蛋白質(zhì)類尿液生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，以期為深入了解與開發(fā)可靠的生物標(biāo)志物提供新的思路與方向。

1 目前公認(rèn)的診斷標(biāo)志物

1.1白蛋白尿：白蛋白尿是早期糖尿病腎病的主要診斷指標(biāo)，也是疾病治療效果的判斷指標(biāo)，在早期GFR正常時(shí)，蛋白尿的微弱增加即可強(qiáng)烈預(yù)測(cè)糖尿病腎病的進(jìn)展[5]。微量白蛋白尿不僅是慢性腎病和終末期腎病風(fēng)險(xiǎn)因子，也是糖尿病患者總死亡率和心血管疾病死亡率以及心血管疾病發(fā)病率的有力預(yù)測(cè)指標(biāo)[6]。但不是所有蛋白尿的患者都會(huì)進(jìn)展為進(jìn)行性腎功能不全，10年后僅有30%～45%的患者發(fā)展為大量白蛋白尿[7]，這與腎病病程進(jìn)展不符。此外，高脂肪攝入、劇烈運(yùn)動(dòng)、胰島素抵抗、高血壓、尿路感染等因素也影響檢測(cè)結(jié)果[8]。因此，微量白蛋白尿診斷預(yù)測(cè)糖尿病腎病的價(jià)值還存在缺陷。

目前，大多數(shù)指南推薦使用尿白蛋白/肌酐(ACR)，使用尿肌酐校正尿量可更客觀的評(píng)估尿蛋白水平。但是檢測(cè)前攝入較多肉類，肌肉劇烈運(yùn)動(dòng)等可影響肌酐水平，因此需要定期隨訪、多次檢測(cè)才能獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

1.2腎小球?yàn)V過率(eGFR)：eGFR反映腎小球的濾過功能，在糖尿病腎病早期eGFR升高，晚期下降。因此eGFR并不能反映早期腎功能損害情況。此外，eGFR的改變與糖尿病腎病的病理機(jī)制無密切關(guān)系，它只是腎臟損害的結(jié)果。目前多采用血漿肌酐(Scr)計(jì)算eGFR，如改良的MDRD[9]。但Scr對(duì)糖尿病腎病診斷并不具特異性，在不存在腎小球或腎小管損傷時(shí)也可能增加。此外，性別、年齡、肌肉代謝營(yíng)養(yǎng)狀況等因素對(duì)Scr的濃度影響很大。比起Scr，胱抑素C(CysC)更加穩(wěn)定，也不受肌肉質(zhì)量的影響。許多研究表明單用CysC或聯(lián)合應(yīng)用CysC、Scr的計(jì)算公式準(zhǔn)確性更高，基于CysC的公式是目前唯一發(fā)現(xiàn)的糖尿病并發(fā)癥獨(dú)立預(yù)測(cè)因子的公式[9]。盡管血清Scr計(jì)算eGFR有許多公認(rèn)的局限性，可是由于其在臨床測(cè)量方便、價(jià)格可接受，一直是腎臟損害的間接標(biāo)志。

2 新型尿液生物標(biāo)志物

糖尿病腎病病變累及腎小球、腎小管、腎間質(zhì)、腎血管等，在尿液白蛋白或eGFR改變以前，這些部位就產(chǎn)生一些微量蛋白質(zhì)隨尿液排出。尿液蛋白質(zhì)成分改變對(duì)腎臟疾病診斷具有重要價(jià)值，加之標(biāo)本無創(chuàng)收集等優(yōu)勢(shì)，尋找糖尿病腎病的早期尿液生物標(biāo)志物成為除傳統(tǒng)活檢之外的一種安全可靠的補(bǔ)充替代診斷方法。

2.1單一尿液生物標(biāo)志物：目前研究較多的是與腎小管/球損傷、腎臟炎性和纖維化相關(guān)的尿液生物標(biāo)志物[10]。見表1。

腎小管的主要功能是重吸收腎小球?yàn)V過的小分子物質(zhì)，高血糖導(dǎo)致葡萄糖濾過增加，腎小管重吸收負(fù)擔(dān)加重，增加腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)的氧氣需求，誘導(dǎo)局部缺血，產(chǎn)生應(yīng)激性標(biāo)志物。研究比較多的是中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(KIM-1)。NGAL在腎小管損傷不久后就釋放，尤其是在血清Scr升高之前。Bancha Satirapoj等人對(duì)T2DM患者進(jìn)行3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)尿液中高濃度NGAL與腎功能快速下降顯著相關(guān)，與ESRD高發(fā)生率也相關(guān)[11]。Fatemeh Abbasi等人的研究也表明NGAL在腎小球損傷標(biāo)志物產(chǎn)生以前就出現(xiàn)[12]。這些結(jié)果提示NGAL可能成為早期糖尿病腎病的一個(gè)補(bǔ)充診斷標(biāo)志物。KIM-1是近端小管細(xì)胞頂端膜上的Ⅰ型跨膜蛋白。KIM-1與近端腎小管損害有關(guān)，代表持續(xù)的內(nèi)在腎小管損傷。Tomohito Gohda等人構(gòu)建模型評(píng)估尿液KIM-1和L-FABP(L型脂肪酸結(jié)合蛋白)對(duì)eGFR降低風(fēng)險(xiǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)尿液KIM-1的水平與ACR呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與死亡風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[13]。Bryan R.Conway等人在大人群樣本的基礎(chǔ)上對(duì)T2DM患者進(jìn)行為期4年的隨訪發(fā)現(xiàn)KIM-1/Cr、uGpnmb/Cr與腎功能下降相關(guān)，也是死亡高風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)指標(biāo)[14]。這些研究結(jié)果提示KIM-1有望成為腎功能下降和死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

腎小球是重要的血漿過濾器。糖尿病造成的高滲、血流動(dòng)力學(xué)改變的環(huán)境會(huì)使腎小球結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。免疫球蛋白G(IgG)在尿液中出現(xiàn)則表明腎小球?yàn)V過屏障受損。Toshio Doi等人對(duì)T2DM患者進(jìn)行為期5年的隨訪，證實(shí)尿IgG4升高與白蛋白尿增加和eGFR下降的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，同時(shí)通過活檢確認(rèn)尿IgG4的水平也與外周腎小球基底膜的表面密度顯著相關(guān)，這是糖尿病腎病的病理改變[15]。這提示IgG4是一個(gè)潛在的糖尿病腎病預(yù)測(cè)指標(biāo)。

炎性因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在糖尿病腎病的發(fā)生中具有重要作用。觸珠蛋白(HPT)是炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，是急性同種異體移植[16]，糖尿病腎病，慢性腎功能不全和腎小球腎炎等疾病的生物標(biāo)志物。Wen-Ling Liao等人的研究發(fā)現(xiàn)HPT和α-1-微球蛋白/比庫寧前體(AMBP)在區(qū)分健康個(gè)體和糖尿病患者有無腎病中具有最高能力并且在后期確證試驗(yàn)中證實(shí)HCR(HPT與肌酐之比)是早期腎功能下降(ERFD)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[17]。

此外，很多研究的生物標(biāo)志物涉及腎臟損傷的各個(gè)部位。在一些研究中[18]表明膠原蛋白、Ig受體、簇蛋白CD99抗原、尿調(diào)蛋白片段、α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白-1在糖尿病腎病進(jìn)展者中的水平也有差異。α1-抗胰蛋白酶同工酶、銅藍(lán)蛋白[19]是區(qū)分糖尿病腎病微量和非蛋白尿的潛在生物標(biāo)志物。但是這些結(jié)果大多只在糖尿病組、糖尿病腎病組與健康對(duì)照組間有差異，具體的早期診斷或預(yù)測(cè)價(jià)值還有待于做大量的縱向研究。見表1[20-29]。

2.2多個(gè)尿液生物標(biāo)志物：糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展是多因素的，涉及多個(gè)病理生理過程，如血液動(dòng)力學(xué)改變、缺血與炎性反應(yīng)、腎素-醛固酮系統(tǒng)功能紊亂、遺傳和表觀遺傳調(diào)節(jié)、足細(xì)胞自噬和線粒體功能缺陷等[30]，目前尚不清楚其發(fā)病機(jī)制，也沒有發(fā)現(xiàn)一種新的生物標(biāo)志物能代替微量白蛋白用于預(yù)測(cè)糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷。使用多個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能更全面。比如CKD273[14，31]，由273種蛋白質(zhì)組成的尿肽分類器，是慢性腎病(CKD)的良好分類器。S.S.Roscioni等人通過三年隨訪并構(gòu)建了基于CKD273 的蛋白尿進(jìn)展模型，結(jié)果表明CKD273可預(yù)測(cè)蛋白尿的發(fā)生進(jìn)展和eGFR的變化，對(duì)糖尿病患者進(jìn)行早期腎臟疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[14]。Petra Zürbig等人在一個(gè)縱向隊(duì)列研究中對(duì)19例T2DM患者進(jìn)行10～15年的隨訪，結(jié)果表明CKD273分類器應(yīng)用于正常白蛋白尿患者時(shí)，可識(shí)別出會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病的患者[32]。盡管研究人數(shù)少，但是它是蛋白質(zhì)組學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為識(shí)別和治療有腎臟疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的2型糖尿病患者的工具的有力證據(jù)。Yongzhang Qin等人使用與腎小球/管損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物TF(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、IgG、β2-微球蛋白、RBP(視黃醇結(jié)合蛋白)、GAL(β-半乳糖苷酶)、NAG(N-乙酰-β-葡萄糖苷酶)構(gòu)建模型，發(fā)現(xiàn)能增加診斷準(zhǔn)確性[33]。Jong Ho Kim等人在微量蛋白尿的基礎(chǔ)之上加入非白蛋白蛋白尿，在T2DM患者中進(jìn)行多年隨訪，顯著提升了疾病預(yù)測(cè)能力[34]。

以上研究表明單一生物標(biāo)志物難以全面反映疾病的發(fā)展過程，聯(lián)合使用幾種生物標(biāo)志物可提高2型糖尿病腎病診斷、預(yù)測(cè)能力。

3 尿液標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

一個(gè)新的生物標(biāo)志物從發(fā)現(xiàn)到進(jìn)入臨床使用需要經(jīng)歷五個(gè)階段[35]。分別為：概念證明階段(①⑤)→驗(yàn)證階段(②③④⑥⑦⑧⑨⑩)→評(píng)估階段→臨床使用階段→臨床驗(yàn)證階段根據(jù)檢索的文獻(xiàn)可知，研究集中于前三個(gè)階段。盡管目前發(fā)現(xiàn)了很多與糖尿病腎病病理過程相關(guān)早期新型生物標(biāo)志物，但由于從糖尿病進(jìn)展至糖尿病腎病是一個(gè)漫長(zhǎng)復(fù)雜的過程，這給臨床實(shí)驗(yàn)帶來很大困難。目前的研究嚴(yán)格終點(diǎn)是ESRD、死亡、ESRD與死亡結(jié)合。但是從糖尿病發(fā)生追蹤至出現(xiàn)ESRD很難也不利于研究的開展，由表1可看出，糖尿病患者出現(xiàn)早期腎功能下降[15](eGFR年平均下降超過3.3%)、由無蛋白尿進(jìn)展至蛋白尿[27]、eGFR輕微下降(30%～40%)[28]、血清肌酐加倍等替代終點(diǎn)逐漸被采用。出現(xiàn)替代終點(diǎn)的結(jié)局事件所需隨訪時(shí)間更短，更利于研究。其中微量白蛋白尿或大量白蛋白尿的出現(xiàn)是有前景的候選替代終點(diǎn)，但是，這些替代終點(diǎn)尚未得到充分驗(yàn)證。除此之外，在表1也可看出大多數(shù)研究都是單中心研究，人群選擇單一，樣本量過少，隨訪期較短，大部分研究沒有對(duì)新的生物標(biāo)志物進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，這是目前研究普遍存在的問題。在長(zhǎng)期隨訪過程中也未能納入對(duì)終點(diǎn)事件有影響的協(xié)變量，如治療方案等。因此證據(jù)并不足以支持進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。

表1 與糖尿病腎病相關(guān)的一些尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物

尿液的收集與儲(chǔ)存方式對(duì)結(jié)果影響很大，長(zhǎng)時(shí)間的冰凍儲(chǔ)存可能導(dǎo)致生物標(biāo)志物的濃度降低以及濃度變異性增加[35]。但是有研究表明尿液在-80℃可儲(chǔ)存8年[31]。在糖尿病腎病研究中很少提到尿液的儲(chǔ)存方式。常用的方法是將尿液儲(chǔ)存在-80℃[13]，有研究提到將收集的尿液進(jìn)行分裝，在-20℃下可儲(chǔ)存2～5年[15]。但是都沒有提到此類儲(chǔ)存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性與可比性，應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)化糖尿病腎病生物標(biāo)志物研究的樣本收集與儲(chǔ)存方式。

綜上所述，用于糖尿病腎病早期診斷和預(yù)測(cè)進(jìn)展的生物標(biāo)志物仍然處于開發(fā)的初始階段，缺乏生物標(biāo)志物用于診斷價(jià)值的數(shù)據(jù)。盡管發(fā)現(xiàn)了很多新型生物標(biāo)志物，很少有研究在臨床中評(píng)估這些生物標(biāo)志物哪一種是最有價(jià)值的。未來的研究方向是進(jìn)一步在更大規(guī)模、更大人種中評(píng)價(jià)尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷及預(yù)測(cè)價(jià)值，如何利用一組生物標(biāo)志物去診斷和預(yù)測(cè)糖尿病腎病。此外，生物標(biāo)志物的應(yīng)用還要綜合考慮標(biāo)本采集、檢測(cè)方法、檢測(cè)費(fèi)用等因素。因此，更多多中心、大樣本、前瞻性研究有待于進(jìn)一步實(shí)施。