四氧嘧啶誘導兔妊娠期糖尿病模型的建立及相關研究

董建中，杜 斌

(中國人民解放軍第968醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是婦女在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖耐量異常性疾病，包括部分孕前已存在糖代謝異常而妊娠期被首次診斷的患者[1]，其患病率在亞洲婦女中為5%～10%，并且該比例在我國和某些發(fā)展中國家仍在不斷上升[2]。妊娠期糖尿病占妊娠期間的糖尿病80%以上[3]，未加控制的妊娠期高血糖可對母嬰產(chǎn)生較大的圍生期及遠期危害，因此對妊娠期糖尿病的研究在臨床和科研方面受到越來越多的重視。探索建立一種妊娠期糖尿病實驗動物模型是對本病深入研究的基礎。以往所建立的糖尿病動物模型多為非妊娠期動物且所用動物多為雄性[4]，對建立妊娠期糖尿病實驗動物模型的文獻罕見，本實驗主要探索建立妊娠期糖尿病動物模型的有效方法。目前建立糖尿病動物模型主要以高糖食物誘發(fā)、化學藥物誘導和手術(shù)切除胰腺等方法為主。食物誘發(fā)與人類糖尿病發(fā)病機制比較接近，但耗時長，飼養(yǎng)條件要求嚴格且動物的死亡率高，限制了其應用[5]；而化學藥物誘發(fā)糖尿病具有方法簡單、血糖穩(wěn)定、耗時短等優(yōu)點，應用相對廣泛[6]；手術(shù)切除胰腺具有創(chuàng)傷嚴重及影響胰腺外分泌，現(xiàn)已很少使用[7]。目前常用誘發(fā)動物糖尿病的化學藥物有鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)[8]，由于鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)價格昂貴，建模成功率低，目前已較少使用。ALX誘導動物糖尿病模型具有經(jīng)濟、方便、耗時短和動物糖尿病模型穩(wěn)定等優(yōu)點。本研究采用ALX成功地建立了妊娠期新西蘭兔糖尿病模型，并對其生物行為學、血糖和胰島素水平及胰島的病理組織學等改變進行了觀察，探討其安全性、穩(wěn)定性、有效性和可行性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1實驗動物：健康成年新西蘭孕兔54只，由中國醫(yī)科大學動物實驗室購買，兔齡1～1.5年，體質(zhì)量3.0～4.3 kg，平均(3.87±0.24)kg，妊娠12～13 d，平均(12.30±0.46)d。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2實驗藥品、試劑與儀器

1.2.1實驗藥品：ALX(美國Sigma公司生產(chǎn))，用前以注射用滅菌生理鹽水配制成質(zhì)量濃度5%的溶液，并用0.22 nm纖維素膜濾過除菌，用于誘導妊娠期兔糖尿病模型。

1.2.2血糖、尿糖及血胰島素測定儀器及試劑：德國羅氏MODLAR D/P型全自動生化分析儀，溫州市維日康生物科技有限公司生產(chǎn)的葡萄糖檢測試劑盒，羅氏血糖儀及試紙。H-800全自動尿分析儀，試紙為瑞迪H-800。胰島素測定試劑為美聯(lián)免疫永附實驗(ELISA)試劑盒(RnD公司)。

1.2.3標本處理：胰腺標本用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋后進行5 μm的連續(xù)切片，用蘇木素-伊紅染色(HE染色法)后光鏡(DMD108觀片機由Leica Microsystems公司)下觀察胰島組織變化及β細胞凋亡情況。

1.3實驗方法：實驗動物分組及模型制作：購回孕兔后，為降低死亡率，均在新環(huán)境條件下飼養(yǎng)2 d，觀察孕兔活躍、多動、機警及皮毛光澤。禁食12 h后取晨尿測尿糖，陰性為合格孕兔。按給藥劑量的不同將孕兔隨機分為A組(對照組)和B組、C組(實驗組)共三組，均靜脈抽血檢測空腹血糖及胰島素值，求其平均值作為基礎的空腹血糖值(兔空腹血糖正常參考值為4.33～8.61 mmol/L)及胰島素基礎值。A組6只孕兔經(jīng)耳緣靜脈給予注射15 ml生理鹽水；B組36只孕兔按100 mg/kg ALX經(jīng)耳緣靜脈注射，48 h后測血糖，誘導模型不成功者，繼續(xù)按100 mg/kg ALX靜脈注射，直至模型成功；C組為12只孕兔按130 mg/kg ALX靜脈注射，48 h后測血糖，誘導模型不成功者繼續(xù)按130 mg/kg ALX靜脈注射，直至模型成功。

三組均在給藥后密切觀察6 h，并用血糖儀隨機檢測血糖，如有低血糖者及時用50%的葡萄糖液15 ml灌胃。注射ALX滿48 h后開始檢測尿糖，每天1次；禁食12 h后經(jīng)耳緣靜脈抽血檢測空腹血糖，隔日1次。以尿糖持續(xù)(++)以上、血糖連續(xù)1周超過16.7 mmol/L并且保持穩(wěn)定為誘導模型成功[9]。期間觀察孕兔的飲食、尿量及精神狀態(tài)等情況。于第1周、2周及4周將造模成功的孕兔任取之一處死，取其胰腺做病理組織學觀察，并與正常孕兔胰腺組織學觀察結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1靜脈注射ALX后孕兔一般狀況：A組新西蘭孕兔在精神狀態(tài)、飲食、活動等方面無明顯的變化，體重增加(0.23±0.05)kg。B組和C組在給藥24 h后出現(xiàn)精神狀態(tài)差、少食懶動、皮毛松散、失去光澤及脫毛等癥狀，其中16只孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)，流產(chǎn)后5只兔死亡，兔在死亡前出現(xiàn)驚厥、尖叫、角弓反張等癥狀。1周后模型成功并成活的32只孕兔出現(xiàn)多食、多飲、多尿及體重略上升(0.22±0.03)kg等癥狀。

2.2各組孕兔糖尿病模型成功率、流產(chǎn)率及死亡率的比較：A組6只孕兔糖尿病模型成功率、流產(chǎn)率及死亡率均為0；B組模型成功率明顯高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，C組的流產(chǎn)率及死亡率均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3注射ALX前后孕兔血糖及胰島素水平的變化：在給藥前后，經(jīng)耳緣靜脈抽血檢測所有孕兔的空腹血糖及胰島素值，見表2。在給藥后2 h測血糖值略有升高[(7.10±0.65)mmol/L]，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在給藥后6 h血糖值下降明顯(4.23±0.27)mmol/L；給藥72 h后孕兔空腹血糖值均大幅上升(34.31±5.62)mmol/L，其中血糖>40 mmol/L的孕兔7只即時給予皮下注射胰島素(1 U/kg)，防止孕兔因高血糖引起流產(chǎn)及高滲性昏迷，甚至死亡。用藥 1周后血糖處于較高水平并保持相對穩(wěn)定。各組于用藥后第2周、第4周查空腹血糖及胰島素值。見表2。

2.4胰腺病理組織學觀察：正常孕兔胰腺HE染色后在低倍鏡可見，胰島形體規(guī)整、數(shù)量較多、分布密集；高倍鏡下可見胰島輪廓圓潤及邊緣整齊，β細胞于胰島內(nèi)密集分布，見圖1a。與對照組相比，孕兔糖尿病組胰腺在低倍鏡下可見胰島呈萎縮狀，數(shù)量減少明顯，分布較稀疏，胰島β細胞的密度降低，見圖1b；在高倍鏡下見不到完整胰島，其形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，胰島胞漿內(nèi)空泡樣變明顯見圖1c；β細胞排列紊亂，細胞核不規(guī)則、縮小，部分核濃染、核固縮，染色質(zhì)分布不均并聚集在核周，β細胞數(shù)明顯減少并分布在胰島周邊，大部分β細胞呈空泡狀，見圖1d。

表1 給藥后三組孕兔成功率、流產(chǎn)率及死亡率的比較

表2 三組孕兔注射ALX前、注射ALX后第2周及4周血糖及胰島素水平的比較

圖1 術(shù)前胸椎黃韌帶骨化MR、CT

3 討論

糖尿病是一種發(fā)病率較高的代謝性疾病，其并發(fā)癥對人類有較高的致殘率和死亡率，而妊娠期糖尿病對胎兒、嬰兒及孕產(chǎn)婦的危害更大，如易發(fā)生巨大兒、肩難產(chǎn)、出生后低血糖、低鈣和呼吸抑制等；孕產(chǎn)婦易發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓病及羊水過多等嚴重并發(fā)癥[10-11]。建立妊娠期糖尿病動物模型對妊娠期糖尿病的基礎與臨床研究具有一定的科學意義。四氧嘧啶誘導的糖尿病模型是目前最常用的1型糖尿病動物模型之一，是評價糖尿病的藥物治療及安全性的常用造模方法[12-14]，其機制是ALX化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，易與SH基(主要是半胱氨酸)發(fā)生反應，而胰島的β細胞中SH基含量較其他組織多，故四氧嘧啶只選擇性地損害胰島的β細胞 ，使其合成胰島素減少，引起內(nèi)分泌功能紊亂，從而導致血糖升高、負氮平衡及體重下降而誘發(fā)該模型糖尿病[12]。此時糖尿病模型動物可出現(xiàn)高血糖、尿糖、多飲多食等典型的人類糖尿病癥狀。以往所建糖尿病動物模型多為非妊娠動物，孕期糖尿病動物模型罕見，本文選用新西蘭孕兔對其施加ALX，成功地建立了妊娠期糖尿病模型，該模型高血糖及低胰島素水平穩(wěn)定且持續(xù)時間長，有明顯的糖尿病癥狀，胰島病理改變明顯，與人類糖尿病病理生理改變相似，所用方法具有造模時間短、操作簡單、成本低、成功率高及易復制等優(yōu)點[15]，以此方法建立的妊娠期糖尿病動物模型可用來了解妊娠期糖尿病對孕產(chǎn)婦和胎兒及新生兒的影響，并為本病發(fā)生機理和臨床治療的研究提供了條件，具有一定的婦產(chǎn)科學意義。

采用ALX誘導動物糖尿病模型應注意[16-17]下幾方面：因為ALX具有水溶性，長時間溶于水會降低藥效，故應現(xiàn)用現(xiàn)配；用藥前試驗用兔應空腹，但禁食時間不宜過長，時間超過24 h會增加兔的死亡率，以往研究及本實驗也證實了以禁食12 h為佳；ALX劑量過大，增加藥物的毒性，引起動物大量死亡，劑量過小而造模成功率低。本研究表明，劑量在100 mg/kg，按此體重劑量重復給藥相對理想，而130 mg/kg組孕兔發(fā)生流產(chǎn)率和死亡率均較高。另外造模成功率還受動物的體重、動物的年齡、ALX的生產(chǎn)廠家、藥物的給藥途徑及給藥速度等因素的影響。本研究是參考有關文獻[18-19]，選用ALX的用量為100 mg/kg及130 mg/kg兩個量組，用藥后觀察孕兔糖尿病模型的成功率及對流產(chǎn)率和死亡率的影響。本文發(fā)現(xiàn)C組(130 mg/kg)注射藥物后，由于大量藥物對孕兔及其胎兔的毒性，導致8只孕兔流產(chǎn)，4只兔死亡，最終模型成功率為僅33.3%。B組(100 mg/kg)第1次注藥后孕兔無流產(chǎn)及死亡，動物模型成功率為47.2%；在第2次給藥后模型成功率提高至77.8%，但出現(xiàn)8只孕兔流產(chǎn)，并且流產(chǎn)后1只兔死亡。因此，應用100 mg/kg兩次給藥較130 mg/kg一次給藥方法的模型成功率明顯提高，而流產(chǎn)率及死亡率卻明顯的下降。由于孕兔的孕期較短(約30 d)，模型建立后可用于實驗研究的剩余時間有限，可以選用其他孕期較長的動物制造糖尿病模型更佳，但需進一步探討研究，而且費用會有所增加。通過本實驗研究，應用ALX制備孕兔糖尿病模型，是一種相對經(jīng)濟、安全、可靠的方法，用小劑型多次給藥的方法優(yōu)于一次性大劑量給藥，降低了流產(chǎn)率、死亡率，提高了模型成功率。