鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠的保護(hù)作用※

●陳克成 魏 宇 丁云錄 陳浩誠(chéng) 李慶杰※※ 劉 爽

（1.吉林金梓源生物科技有限公司 吉林 四平 136000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 吉林 長(zhǎng)春 130021；4.澳大利亞三葉草健康研究院 澳大利亞 悉尼 NSW 2000）

衰老伴隨著記憶力下降、免疫力低下、細(xì)胞凋亡、氧化物水平升高以及腦、胸腺、脾臟、肝、腎等組織器官的退化及病變。衰老是不可避免的，但減慢衰老的速度是可行的，因此找到具有確切效果且作用機(jī)制明確的抗衰老藥物是非常重要的。梅花鹿作為重要的藥用動(dòng)物資源已經(jīng)被廣泛研發(fā)和應(yīng)用，藥用及保健價(jià)值巨大，但鹿腦除了古人應(yīng)用并記載其具有補(bǔ)骨髓、補(bǔ)虛勞、益腦等作用外，尚未在現(xiàn)代醫(yī)藥行業(yè)中見(jiàn)到對(duì)其研究和應(yīng)用，為更好地利用鹿腦，本文對(duì)鹿腦小分子活性多肽進(jìn)行了初步研究。

鹿腦小分子活性多肽是以梅花鹿鹿腦為原料，經(jīng)酶解、提取、分離、純化獲得的分子量范圍在1~6KDa 之間的小分子活性多肽。本研究采用D-半乳糖所致衰老小鼠模型，觀察鹿腦小分子活性肽對(duì)衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為、重要臟器的形態(tài)和病理變化、腦組織BDNF、NGF 含量和腦組織BDNF 蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鹿腦小分子活性肽的抗衰老藥用價(jià)值、延緩腦衰老提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF 級(jí)ICR 小鼠，雌雄各半，體重均在18~22g 之間。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（吉）2018-0007，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)環(huán)境，室溫21～23℃，相對(duì)濕度40%～60%，室內(nèi)12h 明暗自動(dòng)切換，通風(fēng)良好。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)回來(lái)后，分別放入籠中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、喝水。

1.1.2 藥品及試劑鹿腦小分子活性肽，性狀：淺黃色粉末，批號(hào)：20191201，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心提供。吡拉西坦片，規(guī)格：400mg/片，批號(hào)：190821，浙江愛(ài)諾生物藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。D-半乳糖（D-gal），規(guī)格：100g/瓶，批號(hào)：1AN10203，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）試劑盒，規(guī)格：96T/盒，批號(hào)：E20190901A；神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）試劑盒，規(guī)格：96T/盒，批號(hào)：E20190901A，均購(gòu)自美國(guó)RD 公司。組織固定液，規(guī)格：5 000mL/瓶，批號(hào)：18121204，廣州維格斯生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器及器材酶標(biāo)儀，型號(hào)：BIO680，Japan BIO RAD 公司產(chǎn)品；Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，型號(hào)：DB001，北京智鼠多寶科技有限公司產(chǎn)品；圖像分析系統(tǒng)，型號(hào)：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，型號(hào)：OlympusBX51，日本Olympus 公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，型號(hào)：Allegra X-64R，美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)：BHS-6，上海凌科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組選用SPF 級(jí)ICR 小鼠，雌雄各半，共60 只。將用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)7d 后的小鼠，隨機(jī)分配給正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥吡拉西坦（300mg/（kg·d））劑量組、鹿腦肽小分子活性組高劑量組（100mg/（kg·d））、中劑量組（50mg/（kg·d））和低劑量組（25mg/（kg·d））共6 組，10 只/組[1-2]。

1.2.2 造模及給藥建立小鼠衰老動(dòng)物模型，分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和鹿腦小分子活性肽3 個(gè)劑量組，分別皮下注射D-半乳糖150mg/kg，正常對(duì)照組皮下注射等體積生理鹽水，每日注射給藥1 次，連續(xù)6 周。實(shí)驗(yàn)期間自由攝食飲水，節(jié)律光照。在造模的同時(shí)灌注供試藥品混懸液，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌注蒸餾水。每天進(jìn)行1 次灌胃，持續(xù)6 周。每隔一天稱量一次各組小鼠體重，并調(diào)節(jié)給藥劑量[3]。

1.2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)給藥結(jié)束后第2 天進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)時(shí)水的深度為20cm，溫度（25±1）℃，將小鼠從第二象限標(biāo)記處逐個(gè)放置在水池中，并使小鼠面對(duì)墻壁，自動(dòng)錄像系統(tǒng)記錄了小鼠從下水到爬上平臺(tái)的時(shí)間（以四肢爬上平臺(tái)為準(zhǔn)），這就是逃避潛伏期。如果小鼠在2min 內(nèi)不能到達(dá)平臺(tái)，就要將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)，時(shí)間記為2min。當(dāng)小鼠爬上平臺(tái)休息10s 后，進(jìn)行其他小鼠的測(cè)試，每只小鼠每天1 次，共4d。第5 天，撤除平臺(tái)，面向池壁將小鼠放入水池中，以小鼠首次通過(guò)平臺(tái)的時(shí)間和2min 內(nèi)通過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]。

1.2.4 取材及檢測(cè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1%戊巴比妥0.5～1.0mL 腹腔麻醉，解剖取腦，稱量全腦重量，按公式計(jì)算腦指數(shù)；剪取一部分腦組織，用組織固定液固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，做病理組織學(xué)檢查；采用免疫組化SABC 法觀察切片BDNF 的水平。另稱切取腦組織100mg，冷生理鹽水沖洗，加入冷生理鹽水進(jìn)行勻漿，將得到的勻漿液在0～4℃溫度下以3 500r/min 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，15min 后將所得上清液按說(shuō)明書(shū)方法操作，通過(guò)ELISA 試劑盒對(duì)BDNF、NGF 含量進(jìn)行測(cè)定[5]。解剖胸腺和脾臟，去除表面脂肪膜，用冷鹽水沖洗組織表面上的殘留血液，用濾紙吸干，稱重后計(jì)算內(nèi)臟指數(shù)。計(jì)算公式：

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠明顯增加了逃避潛伏期、減少了穿臺(tái)次數(shù)（P<0.01）。鹿腦小分子活性肽劑量為100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 劑量組時(shí)，與模型組相比，逃避潛伏期縮短，穿臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.01 或P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠逃避潛伏期及穿臺(tái)次數(shù)的影響

2.2 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)均顯著下降（P<0.01），這表明D-半乳糖所致衰老小鼠的腦和其他免疫器官等在逐漸發(fā)生萎縮。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三個(gè)劑量組小鼠胸腺指數(shù)均有不同程度增加，與模型對(duì)照組比較，有顯著性差異（P<0.01 或P<0.05）；鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 兩個(gè)劑量組中小鼠腦指數(shù)、脾臟指數(shù)均有一定程度的增長(zhǎng)，與模型對(duì)照組比較，表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.01 或P<0.05）。說(shuō)明鹿腦小分子活性肽能表現(xiàn)出不同程度的抗腦萎縮和抑制衰老模型小鼠胸腺和脾臟的退化作用，增強(qiáng)小鼠免疫功能。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦、胸腺和脾臟指數(shù)的影響

2.3 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，模型組中小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量顯著減少（P<0.01）。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg兩個(gè)劑量組小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量顯著增加，與模型組大鼠比較差異顯著（分別為P<0.01 或P<0.05）；鹿腦小分子活性肽25mg/kg劑量組小鼠腦組織中BDNF 含量，與模型組大鼠比較，具有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達(dá)明顯降低，具有顯著性差異（為P＜0.01）。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三個(gè)劑量組與模型對(duì)照組比較，小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達(dá)明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 鹿腦小分子活性肽對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量及BDNF 蛋白表達(dá)的影響

2.5 衰老小鼠腦組織HE 染色組織病理學(xué)變化

圖1-6 結(jié)果顯示，正常對(duì)照組，小鼠腦組織的細(xì)胞膜連續(xù)、完整，海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小正常，細(xì)胞排列緊密有序，胞質(zhì)充盈，能清晰地看到細(xì)胞核、核仁和胞漿。模型對(duì)照組，小鼠腦組織出現(xiàn)部分深染的現(xiàn)象，細(xì)胞變小，細(xì)胞核呈固縮、破碎狀；海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，排列紊亂、疏松， 形態(tài)不規(guī)則， 胞核模糊、固縮和胞漿減少，細(xì)胞不再充盈、結(jié)構(gòu)變得模糊不清，表明有部分腦細(xì)胞發(fā)生壞死。與模型組比較，吡拉西坦組、鹿腦小分子活性肽高、中、低劑量組均可明顯改善上述病理改變，細(xì)胞壞死較輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)完整，且細(xì)胞的邊緣清晰，染色質(zhì)較為均勻，其中鹿腦小分子活性肽高劑量組減輕腦細(xì)胞壞死的作用最為顯著，中、低劑量組作用與高劑量組比較略弱。

3 討論

衰老是整個(gè)人體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能全面下降的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，防治衰老所致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、延緩腦衰已成為當(dāng)今衰老生物學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究課題[6-11]。以鹿腦小分子活性肽為研究對(duì)象，通過(guò)制備衰老小鼠模型，探討了鹿腦小分子活性肽抗衰老作用、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型是國(guó)內(nèi)外比較公認(rèn)的動(dòng)物衰老模型，成模動(dòng)物顯示的各種老化現(xiàn)象與自然衰老相似，現(xiàn)已被廣泛用于抗衰老藥物的篩選和衰老的機(jī)理研究中[12-18]。而學(xué)習(xí)過(guò)程中所體現(xiàn)出來(lái)的記憶能力是評(píng)價(jià)腦衰老重要指標(biāo)中的一個(gè)[19-21]。在這項(xiàng)研究中，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)定小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越原始平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少，提示模型組小鼠已有腦衰老的行為學(xué)表現(xiàn)。與模型對(duì)照組相比，鹿腦小分子活性肽各給藥組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越原始平臺(tái)位置次數(shù)明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹿腦小分子活性肽能夠干預(yù)衰老進(jìn)程，可以顯著拮抗D-半乳糖對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損傷。

臟器及腺體指數(shù)的變化可以初步衡量機(jī)體衰老程度。脾臟為體內(nèi)最大的外周免疫器官，主要功能是為各種成熟的淋巴細(xì)胞提供免疫應(yīng)答場(chǎng)所；胸腺是免疫調(diào)節(jié)的中心器官，對(duì)免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫功能的發(fā)生有重要作用；胸腺、脾臟和腦重量均會(huì)隨著機(jī)體的老齡化進(jìn)程而變輕，是反映動(dòng)物在衰老變化過(guò)程中的主要指標(biāo)，因此，腦、胸腺和脾臟指數(shù)的降低可間接反應(yīng)機(jī)體的衰老程度。本次實(shí)驗(yàn)研究可以得出，鹿腦小分子活性肽具有延緩小鼠臟器退化、提高免疫力及促進(jìn)新陳代謝的作用，能有效增強(qiáng)衰老小鼠的體質(zhì)，減緩小鼠腦萎縮及臟器功能的下降。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain derived neurotrophic factor， BDNF）是在大腦中合成的蛋白質(zhì)，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布也十分廣泛，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不斷地發(fā)育進(jìn)程中，能夠?qū)ι窠?jīng)元的存活狀態(tài)、分化情況、生長(zhǎng)發(fā)育中都具有至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程和治療中也有BDNF 的參與，cAMP/PKA/CREB/BDNF 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的認(rèn)知功能障礙有關(guān)[22-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鹿腦小分子活性肽可以逆轉(zhuǎn)D-半乳糖所引起的cAMP/PKA/CREB 抑制作用，在細(xì)胞水平可以明顯提高D-半乳糖所致的BDNF 分泌降低作用，這也提示了鹿腦小分子活性肽在衰老動(dòng)物模型中抗衰老作用可能是通過(guò)提高cAMP/PKA/CREB/通路的活性，促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)元BDNF 的表達(dá)和分泌，防止受損神經(jīng)元的死亡，改變神經(jīng)元的一系列病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生和分化，并在成熟的中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中維持神經(jīng)元的存活和正常的生理功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹿腦小分子活性肽干預(yù)后，衰老小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中空間認(rèn)知功能得到改善，學(xué)習(xí)記憶功能得到提高；可以減緩小鼠腦萎縮及胸腺、脾臟功能的下降，可以明顯提高D-半乳糖所致腦組織中降低的NFG、BDNF 水平；能抑制腦組織病變，減少腦細(xì)胞凋亡，從而維持細(xì)胞和組織的正常功能，達(dá)到保持機(jī)體健康和延緩衰老的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，鹿腦小分子活性肽可能具有改善腦血流，營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)細(xì)胞，使受損神經(jīng)細(xì)胞（或休眠的神經(jīng)細(xì)胞）得到修復(fù)或激活作用，它可能對(duì)促進(jìn)缺血區(qū)域側(cè)支循環(huán)的建立起積極作用。