超聲-溶劑萃取去除銀杏葉提取物中的銀杏酸

劉茜倩，劉伶文，王曉軍， 武翰文

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

0 引 言

銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是以銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的干燥葉經(jīng)加工制成的一類產(chǎn)品。其品質(zhì)主要取決于銀杏黃酮和銀杏萜內(nèi)酯的含量[1-4]。銀杏葉中除有效成分黃酮類、萜內(nèi)酯類外，還含有微量的，具有致敏性、致突變、細(xì)胞毒性等作用的銀杏酸[5-7]?？梢种拼竽X內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)變成γ-氨基丁酸，進(jìn)而使大腦細(xì)胞功能喪失[5]。近年來，銀杏酸的藥理作用，尤其是在抗腫瘤、抑菌殺菌、抗病毒、殺蟲和抗氧化活性等方面研究逐步深入[8-10]。

目前，分離銀杏酸的常用手段是化學(xué)提純。除此之外，熱回流法、堿提酸沉法、柱層析分離、超臨界CO2萃取、大孔吸附樹脂富集等也是經(jīng)常采取的方法。熱回流法溶劑多采用乙醇。該法雖簡單，但提取率低且不利于與銀杏黃酮等成分分離，對銀杏葉提取物藥理作用影響較大[11]。馬慧等采用堿提酸沉法提取銀杏酸。經(jīng)優(yōu)選的提取工藝操作簡單、穩(wěn)定易行, 但產(chǎn)品純度不高、酸消耗量大，需要脫鹽純化。同時(shí)，酸堿作用易影響銀杏葉提取物中其他活性成分，不適用于銀杏葉提取物中銀杏酸的去除[12]。超臨界CO2萃取法具有操作方法簡便、有機(jī)溶劑使用量少、得率高、純度高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，但該工藝成本較高，不利于大量生產(chǎn)[13]。唐仕榮等采用大孔徑樹脂和高速逆流色譜聯(lián)合分離，制備高純度銀杏酸單體組分，可有效分離純化銀杏酸組分，但該方法主要用于銀杏酸單體組分的開發(fā)利用[14]。

和上述萃取技術(shù)相比，超聲波萃取速度快、價(jià)格低、效率高，不需求高溫，具有廣譜性[15-16]。超聲波萃取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)等一系列物理、化學(xué)效應(yīng)，通過增大生物細(xì)胞的破碎程度、介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、穿透力以萃取生物有效成分[17-18]。為降低銀杏葉提取物中由銀杏酸帶來的毒副作用，本文用超聲輔助溶劑萃取去除銀杏酸。對銀杏葉提取物中銀杏酸的去除工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立一種低投入、耗時(shí)短、易放大并降低GBE毒副作用的工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

銀杏葉粉末(市購，去毒、洗凈、磨粉后過篩備用)；單體銀杏酸(上海源葉生物科技有限公司)；正己烷、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸、甲醇、乙醚、環(huán)己烷等試劑均為分析純。

Biosafer650-92型超聲波細(xì)胞粉碎儀(賽飛(中國)有限公司)；ZF-6型三用紫外儀(北京市六一儀器廠)；754PC型分光光度計(jì)(上海菁華科學(xué)儀器有限公司)；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)。

1.2 銀杏酸的提取及檢測

以銀杏葉粉末為原料，用70%乙醇為提取液。按照料液比1∶8，常溫下浸提15 min;在功率190 W下，超聲提取40 min;再經(jīng)抽濾、離心，得到銀杏葉粗提液。將銀杏葉粗提液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行旋蒸，得到濃縮膏。

取銀杏葉濃縮膏，稀釋后加一定的萃取溶劑，按照一定的液料比、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲間隔時(shí)間進(jìn)行萃??；在分液漏斗中靜置分層，用UV法分別測定萃取后上相和下相中銀杏酸的含量，計(jì)算銀杏酸的去除量Q。

(1)

式中：Q為銀杏酸的去除量，mg/g；V1為層析樣品的體積，mL；C1為樣品中銀杏酸的質(zhì)量濃度，g/mL；V為濃縮膏總體積，mL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20 mg銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.08 mg/mL的銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于200～800 nm之間進(jìn)行光譜掃描。因在310 nm處有最大吸收峰，故選擇測定波長為310 nm。

用甲醇分別配置質(zhì)量濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定310 nm處的吸光度。以銀杏酸質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為

Y=4.684 3x-0.003 8，R2=0.999 1

1.4 樣品中銀杏酸的檢測

準(zhǔn)確量取分液所得上、下相各5 mL，分別定容至10 mL，用微量注射器取0.2 mL在已制備好的薄層硅膠板上進(jìn)行條狀點(diǎn)樣，以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(冰醋酸)=18∶1∶1作為展開劑展開后，置于三用紫外儀下，在254 nm波長處觀察，銀杏酸發(fā)出藍(lán)色熒光。選取顯藍(lán)色熒光的部分進(jìn)行甲醇洗脫，洗脫液分別定容至10 mL，然后進(jìn)行UV檢測。

以甲醇為參比，取樣品于310 nm處測定吸光度值，通過線性回歸方程計(jì)算銀杏酸的濃度，從而算出銀杏酸的去除量。

1.5 超聲輔助溶劑萃取去除銀杏酸的工藝條件

綜合考慮銀杏酸去除過程中溶劑的極性和毒性、揮發(fā)性和經(jīng)濟(jì)性，最終選用正己烷作為萃取劑。通過單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、間隔時(shí)間、超聲次數(shù)對銀杏葉提取物中銀杏酸去除量的影響。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化確定最佳萃取工藝

綜合各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對銀杏酸去除量影響最大的3個(gè)因素，分別在其最優(yōu)值周圍選取3個(gè)水平，采用Design-expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化超聲波輔助溶劑萃取銀杏酸的工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比 料液比對銀杏酸萃取去除效果的影響如圖1所示。

圖 1 料液比對銀杏酸去除量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the amount of ginkgolic acid

在所選料液比的區(qū)域內(nèi)，銀杏酸的去除量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；在1∶20時(shí)達(dá)到最大，去除量為3.18 mg/g。一方面當(dāng)溶劑量較小時(shí)，萃取易達(dá)到飽和，去除量較低；當(dāng)溶劑量增多時(shí)，萃取量增加，去除量也增高。另一方面，萃取過程遵循相似相溶原則[19]，隨著正己烷投量的增加，極性不斷降低。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)正已烷極性與銀杏酸相當(dāng)，萃取量達(dá)到最大。由此，選定料液比為1∶20。

2.1.2 超聲功率 超聲功率對銀杏酸萃取去除效果的影響如圖2所示。隨著超聲功率的增加，銀杏酸的去除量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在超聲功率為320 W時(shí)達(dá)到最大，為3.41 mg/g。超聲波功率越大，空化作用和機(jī)械作用越強(qiáng)烈，介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力越大[17]，總銀杏酸溶出越多。但當(dāng)超聲波功率超過320 W后，由于熱效應(yīng)增大，溶劑升溫較快且易揮發(fā)，導(dǎo)致液料比減少，萃取不充分。同時(shí)，功率過大破壞了銀杏酸結(jié)構(gòu)，去除量降低。由此，選定超聲功率為320 W。

圖 2 超聲功率對銀杏酸去除量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the removal amount of ginkgolic acid

2.1.3 超聲時(shí)間 超聲時(shí)間對銀杏酸的萃取去除效果的影響如圖3所示。

圖 3 超聲時(shí)間對銀杏酸去除量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the removalamount of ginkgolic acid

超聲時(shí)間在10～15 min時(shí)，銀杏酸的去除量上升，并在15 min時(shí)達(dá)到最高的2.73 mg/g;15 min后，銀杏酸的去除量下降。這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)能夠促使介質(zhì)分子的穿透力增大，進(jìn)而使胞內(nèi)銀杏酸釋放。但超聲波持續(xù)工作可能會破壞銀杏酸的結(jié)構(gòu)，同時(shí)有可能破壞銀杏葉提取物中其他組分結(jié)構(gòu)。由此，選定超聲時(shí)間為15 min。

2.1.4 超聲間隔時(shí)間 超聲作用時(shí)間間隔對銀杏酸萃取去除效果的影響如圖4所示。

圖 4 超聲間隔時(shí)間對銀杏酸去除量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time interval on the removal amount of ginkgolic acid

隨著超聲間隔時(shí)間的增加，銀杏酸的去除量逐漸上升，在0.5 s時(shí)達(dá)到最大，為3.19 mg/g。之后，銀杏酸去除量呈下降趨勢。原因是改變超聲間隔時(shí)間，相當(dāng)于改變了超聲作用的頻率，間隔時(shí)間越長，頻率越低。頻率的改變直接影響機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)等一系列物理、化學(xué)效應(yīng)。較低頻率超聲有利于可溶物的釋放，和溶劑的滲透，提高活性成分的轉(zhuǎn)移[20]。但當(dāng)超聲間隔時(shí)間較長時(shí)，震動(dòng)頻率較低，又不利于銀杏酸的溶出。由此，選定超聲間隔時(shí)間為0.5 s。

2.1.5 超聲次數(shù) 超聲次數(shù)對銀杏酸萃取去除效果的影響如圖5所示。

圖 5 超聲次數(shù)對銀杏酸去除量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic frequency on the amount of ginkgolic acid

隨著超聲次數(shù)的增加，銀杏酸去除量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在提取次數(shù)為2次時(shí)，銀杏酸的去除量最大，為3.37 mg/g。這是由于超聲次數(shù)的增加可以提高萃取效率，但多次的超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)也可能對提取物的結(jié)構(gòu)造成破壞，超聲次數(shù)對銀杏酸結(jié)構(gòu)的影響還有待深入研究。由此，選定超聲次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型 分別選取液料比(A)、超聲時(shí)間(B)和超聲功率(C)為自變量，以銀杏酸去除量(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的中心組合實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。用Design-Expert 8.0.6軟件對表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立二次多元回歸模型：

Y=3.40-0.025A-0.026B+0.006C+0.005AB+

0.012BC-0.078A2-0.066B2-0.14C2

表 1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型方差分析 回歸模型的方差分析結(jié)果見表2 。

表 2 響應(yīng)面回歸模型方差分析Tab.2 The results of analysis of variance for response surface regression model

2.2.3 最優(yōu)條件確定及模型驗(yàn)證 料液比、超聲時(shí)間和超聲功率對銀杏酸去除量的影響如圖6所示。由圖6中等高線的形狀可以看出：3個(gè)因素的效應(yīng)大小依次為超聲時(shí)間(B)、料液比(A)、超聲功率(C)；這3種交互項(xiàng)的效應(yīng)大小依次為：超聲時(shí)間和超聲功率(BC)、料液比和超聲時(shí)間(AB)、料液比的超聲功率(AC)。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析確定最優(yōu)操作條件，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，料液比、超聲時(shí)間和超聲功率對應(yīng)的最佳值分別為1∶19.17、13.97 min和320 W。在此條件下，銀杏酸去除量為3.468 mg/g。為了驗(yàn)證模型方程的適用性，以及在實(shí)際應(yīng)用中的可行性，提取條件調(diào)整為料液比1∶19、超聲14 min、超聲功率320 W。在此條件下重復(fù)驗(yàn)證3次，得到的銀杏酸去除量為3.463 mg/g，與預(yù)測值吻合度好，說明響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化銀杏酸萃取去除最佳條件準(zhǔn)確可靠。

(a) 料液比、超聲時(shí)間對去除量的影響

(b) 料液比、超聲功率對去除量的影響

(c) 超聲時(shí)間與超聲功率對去除量的影響圖 6 銀杏酸去除量影響因素的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of factors affecting ginkgolic acid removal

3 結(jié) 語

本文研究了超聲波輔助溶劑萃取法去除銀杏葉提取物中銀杏酸的工藝條件。采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏酸去除的工藝中的超聲時(shí)間、超聲功率、料液比、超聲間隔時(shí)間、超聲次數(shù)等因素。以正己烷為溶劑，確定了最佳工藝條件：超聲提取14 min、超聲功率320 W、料液比1∶19，超聲間隙時(shí)間為每5 s間隔0.5 s，超聲處理2次。在上述條件下，銀杏酸的去除量為3.463 mg/g，與預(yù)測值3.468 mg/g吻合度好，表明響應(yīng)面模型具有可預(yù)測性。此外，由各個(gè)因素的方差分析可知：影響因素的大小依次為超聲時(shí)間、料液比、超聲功率。超聲波輔助溶劑萃取銀杏葉提取物中的銀杏酸的工藝穩(wěn)定可行、溶劑用量少、耗時(shí)短。該方法可作為銀杏葉提取物中銀杏酸的控制手段，有效降低銀杏葉提取物的毒副作用，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。