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    排連珠狀蠶糞癥狀蠶病的鑒定研究
    ——以云南省祥云縣蠶區(qū)為例

    2021-04-19 08:47:02范永慧張永紅王永生吳銀吉
    廣西蠶業(yè) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:連珠蠶病蠶體

    范永慧,張永紅,王永生,吳銀吉

    (云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,蒙自市 661101)

    祥云縣是云南蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點縣之一,現(xiàn)有桑園面積6 866.7 hm2,2019 年全縣年發(fā)種量約15萬張,鮮繭產(chǎn)量約0.6萬t,蠶桑綜合產(chǎn)值達34億元[1]?,F(xiàn)已建成青坡、松梅、新澤等30多個蠶桑重點村和科技示范村。2018—2019 年,各蠶區(qū)已零星出現(xiàn)排連珠狀蠶糞的病蠶,當(dāng)?shù)匦Q農(nóng)根據(jù)經(jīng)驗初步診斷為細(xì)菌性腸道病,但沒有引起足夠重視。2019 年8 月初開始飼養(yǎng)的正秋蠶普遍發(fā)生該病,尤其是最大的養(yǎng)蠶村——松梅村受影響最嚴(yán)重,具體情況為飼養(yǎng)量約4 500張,受此病害損失近1 000張,造成蠶農(nóng)經(jīng)濟損失慘重。

    通過調(diào)研發(fā)現(xiàn),這種蠶病在3齡蠶中發(fā)生較少,5齡起蠶后病勢嚴(yán)重,隨即迅速擴散,至第3~4 d 暴發(fā),肉眼觀察病征表現(xiàn)為群體發(fā)育不齊,食桑量少且不活潑,繼而蠶體變小,最后停止食桑死亡,蠶體腐爛;撕開病蠶體壁觀察中腸,腸內(nèi)桑葉很少,充滿黃綠色液體。病蠶最顯著特征就是排連珠狀蠶糞,具體表現(xiàn)為幾顆蠶糞之間有絲相連,像一串念珠,也可表述為念珠狀蠶糞。查閱相關(guān)文獻資料可知,排連珠狀蠶糞或念珠狀蠶糞的蠶病分別有細(xì)菌性腸道?。?-3]、濃核病[4-6]、黑尾?。?]、壁虱病[8],另外,氯蟲苯甲酰胺導(dǎo)致蠶中毒[9]也會出現(xiàn)排連珠狀蠶糞。

    家蠶濃核病毒(Bombyx mori Densovirus,BmDNV),又稱家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV),BmDNV 存在不同的株系和基因組類型(BmDNV 1~6 型、BmDNV-Z 型),中國流行的病毒以BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-3(桐鄉(xiāng)株)的分離株為主。筆者對病蠶的中腸進行鏡檢,未發(fā)現(xiàn)球形細(xì)菌,結(jié)合上述幾種蠶病的主要病征和蠶戶養(yǎng)蠶各環(huán)節(jié)技術(shù)操作情況及低溫多濕的飼養(yǎng)環(huán)境,初步推測為家蠶濃核病,但需通過PCR 分子檢測方法和感染試驗近一步來確認(rèn)是否為BmDNV。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 家蠶品種 菁松×皓月,由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶研究室提供。

    1.1.2 病毒取樣 家蠶濃核病毒BmDNV的病蠶樣品采集于云南省祥云縣正秋蠶期的排連珠狀蠶糞蠶病最嚴(yán)重,發(fā)病量高達20%以上的松梅村的4家農(nóng)戶。

    1.1.3 引物和主要試劑 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫上已登陸的BmDNV-3 株基因組片段VD1 ORF2 序列設(shè)計特異性引物(表1),由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系(10×PCR buffer、dNTPs和Ex-Taq聚合酶)、50×TAE電泳緩沖液、瓊脂糖購于上海生工生物工程公司。

    1.2 病毒生物學(xué)鑒定方法

    1.2.1 檢測依據(jù) 根據(jù)NCBI 已報道BmDNV-3(DQ017268)基因組VD1 ORF2序列(大小為975 bp)設(shè)計特異性引物,通過PCR 產(chǎn)物大小來判斷采集的病蠶樣品是否感染BmDNV。

    1.2.2 病毒粒子收集與基因組提取 取病蠶中腸組織用滅菌水研磨,紗布過濾勻漿液,4 000 rpm離心20 min,過濾數(shù)次,收集病毒混合液加到含1 mL基因組抽提液(10 mmol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.1 mol/L EDTA,pH 8.0;0.5%SDS)的離心管中同時加入蛋白酶K 在55 ℃下水浴消化2 h;用Tris平衡酚、酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶l)、氯仿各抽提1次;用無水乙醇沉淀基因組,70%乙醇洗滌DNA,最后用適量TE溶液溶解沉淀,溶液用于PCR檢測[10]。

    1.2.3 病毒基因組PCR擴增檢測 參照張永紅等[10]方法以抽提的病毒基因組作為模板進行PCR 擴增,反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(Mg2+)5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,cDNA 模板1 μL,Ex-Taq DNA 聚合酶0.25 μL,上下游引物各1 μL,加ddH2O至50 μL;反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),在72 ℃下終止延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

    1.3 病原感染力、感染癥狀試驗方法

    將病毒混合液涂抹于桑葉背面,稍晾干后分別添食于4 齡起蠶和5 齡起蠶,各齡添毒分A、B、C 和CK 4 組。A 組直接添食病毒混合液,B 組添食稀釋10倍的病毒混合液,C組添食病毒混合液,每天添食1 次鹽酸環(huán)丙沙星(人用),1 粒兌500 mL 水。CK 組飼喂正常葉,4 齡添食每組50 頭蠶,5 齡添食每組30頭蠶,3個重復(fù),餉食添毒1次后開始飼喂正常桑葉,家蠶飼養(yǎng)置于同一溫濕度環(huán)境下,操作方法一致,每天給桑3次,觀察記錄家蠶的生長狀況、病情及病程,并解剖癥狀明顯、尤其是排連珠狀糞便的蠶兒,觀察中腸病變。最后,分別收集添食4齡起蠶和5齡起蠶發(fā)病后的病蠶,提取病毒粒子及病毒基因組再次進行PCR擴增確認(rèn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病毒生物學(xué)鑒定的PCR檢測結(jié)果

    祥云縣4 戶蠶農(nóng)病蠶樣品抽提基因組后,VD1 ORF2上下游引物進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測發(fā)現(xiàn)與目的片段大小基本一致的條帶(圖1),初步確定該地區(qū)2組(第3和第4)樣品家蠶感染BmDNV。

    圖1 祥云縣4個樣品的病蠶基因組BmDNV3--F/R PCR擴增檢測結(jié)果

    2.2 病原感染力、感染癥狀試驗

    2.2.1 4齡添食感染試驗結(jié)果 96 h后CK組全眠,B、C 組眠1/2,A 組大多數(shù)不眠(圖2),B 組未眠蠶排連珠狀糞便。120 h后,A、B、C組未眠蠶出現(xiàn)排連珠狀糞便,A組蠶整體比其他組瘦小,且只有1/3蠶眠,未眠蠶爬于飼養(yǎng)盒壁,食桑量很少,蠶體瘦小,尾角后方粘有一粒不成形蠶糞,B、C 組個別未眠。156 h后,5 齡餉食,A 組未眠蠶排褐色液體,逐漸停止食桑,蠶體縮短,體色為米黃色,和5 齡起蠶顏色很相似。5齡第1 d到第6 d,A、B、C每組每天均出現(xiàn)排連珠狀蠶糞蠶兒(圖3、圖4),對照CK組,蠶體開差程度表現(xiàn)為:A 組>B 組>C 組(圖5、圖6),食桑量表現(xiàn)為:A組<B組<C組。5齡第3 d,A組和B組體色不轉(zhuǎn)青,排稀糞,蠶體縮小,現(xiàn)死蠶,C組與CK組對照,除個別體色不轉(zhuǎn)青,其余并無差別。5 齡第6 d,C 組蠶兒開始爬邊,體軀比CK組小,體色較CK組體色偏黃。A 組和B 組出現(xiàn)的死蠶,皮干皺縮呈米黃色,不易腐爛(圖7),解剖可見中腸腸腔前端沒有桑葉,中部充滿淡黃色腸液,腸液中有較少綠色桑葉(圖8)。

    圖2 不眠蠶

    圖3 排連珠狀蠶糞

    圖4 排連珠狀蠶糞

    圖6 4齡添食群體發(fā)育狀況

    圖7 病死蠶

    圖8 排連珠狀蠶糞蠶體解剖

    2.2.2 5齡添食感染試驗結(jié)果 前3 d和CK組無明顯變化,第4 d的A、B組現(xiàn)排連珠狀蠶糞個體,第5 d的A 組食桑量減少,蠶體瘦小,體色偏黃,第8 d 的CK 組正常上蔟,A 組蠶體開差大于B 組,C 組和CK組無差別,只是個別不結(jié)繭,第9 d上午的結(jié)繭數(shù)為C組>B組>A組。

    家蠶添食帶毒桑葉試驗中,4 齡起蠶添毒后第3~4 d出現(xiàn)明顯癥狀,5齡起蠶添毒后第5~7 d出現(xiàn)癥狀。主要癥狀表現(xiàn)為:初始階段群體中出現(xiàn)食桑逐漸減少、行動遲緩、爬于蠶座邊緣、排連珠狀蠶糞,眠期表現(xiàn)為遲眠或不眠,不蛻皮或半蛻皮,中期體色由青白轉(zhuǎn)成米黃色,體軀瘦小,體長縮短,排稀糞,末期停止食桑,平伏于蠶座至死亡的個體。

    通過病蠶樣品PCR 檢測初步確診,再到添毒試驗發(fā)病病癥的相似,結(jié)合再次對添毒發(fā)病蠶進行PCR檢測(圖9所示,第1~3頭為4齡添食發(fā)病蠶、第4~6 頭為5齡添食發(fā)病蠶),最后可以確診祥云蠶區(qū)排連珠狀蠶糞癥狀的蠶病為家蠶病毒病濃核病。

    3 討論與建議

    3.1 討論

    由于排連珠狀蠶糞或念珠狀蠶糞的蠶病有多種,由此,在云南祥云縣發(fā)生的排連珠狀蠶糞癥狀的蠶病可能不是同一種病,但都具有很強的傳染能力,且造成了一定的經(jīng)濟損失。不同蠶病的發(fā)病機理、發(fā)病過程、飼育環(huán)境也不同,結(jié)合祥云縣蠶病病征、飼料質(zhì)量管理、蠶室內(nèi)外環(huán)境、養(yǎng)蠶人員的皮膚無紅疹狀和發(fā)癢、發(fā)病急緩等情況,可以排除是黑尾病、壁虱病、氯蟲苯甲酰胺導(dǎo)致的蠶中毒[7-9]造成的危害。家蠶在高溫、多濕、低質(zhì)飼料和飼養(yǎng)管理差等不良條件的沖擊下容易引起細(xì)菌性腸道?。?1];低溫、多濕、葉子差等不良飼養(yǎng)管理則易引起濃核病。隨著抗BmNPV家蠶品種的應(yīng)用推廣,細(xì)菌性腸道病的發(fā)生更為普遍。本次試驗為能更好地區(qū)別濃核病和細(xì)菌性腸道病,主要通過從病蠶獲得病原為主要依據(jù),再給家蠶添食病原輔以添食抗生素進一步確診。在本次添毒試驗中,C 組的蠶兒發(fā)育情況表明,鹽酸環(huán)丙沙星可能對濃核病毒有一定的抑制作用,其相關(guān)的抑制機理還有待進一步研究。另外,5齡添食病原比4 齡添食發(fā)病慢、發(fā)病輕的情況可以看出,隨著蠶兒齡期的增長,蠶體抵抗力在不斷增強。試驗情況與發(fā)病蠶區(qū)5 齡3~4 d 暴發(fā),病死蠶腐爛有所不同,原因可能是與養(yǎng)蠶季節(jié)、環(huán)境、飼養(yǎng)數(shù)量和感染齡期等有關(guān)。試驗經(jīng)過PCR分子檢測方法和感染試驗可確定該蠶病屬病毒病濃核病,為祥云縣蠶區(qū)的下一步蠶病防控提供依據(jù)。

    3.2 建議

    根據(jù)家蠶濃核病的發(fā)病規(guī)律及該病流行病學(xué)的特點,在防治時必須貫徹“預(yù)防為主,綜合防治”的方針,同時提高蠶農(nóng)防控意識,加強桑園科學(xué)管理與飼養(yǎng)管理。

    3.2.1 增強蠶農(nóng)消毒防控意識,掌握科學(xué)的防治措施 BmDNV主要通過食下傳染[11],蠶座中的垂直感染是造成濃核病蔓延的主要原因之一,BmDNV也可能通過病蠶尸體及蠶室土壤實現(xiàn)病毒的越冬,所以要強化“三消一洗”的消毒防病工作,各項具體操作要落實到位。養(yǎng)蠶前,做好蠶室、貯桑室、蠶具、蔟具、飼養(yǎng)區(qū)域的清洗及消毒,消滅越冬病原,切斷傳播途徑;養(yǎng)蠶結(jié)束后認(rèn)真搞好“回山”消毒,及時清理病死蠶尸體、蠶糞、及霉?fàn)€的蠶繭等,將蠶室、大小蠶具、蔟室蔟具等洗凈并徹底消毒,防止病原擴散,有效降低病原越冬基數(shù);蠶期要抓好眠起處理,注意觀察青頭蠶、遲眠蠶,發(fā)現(xiàn)病蠶,正確診斷,及時隔離淘汰病蠶,進行蠶體蠶座消毒,防止蠶座傳染。建立和嚴(yán)格執(zhí)行經(jīng)常性的防病衛(wèi)生制度。加強蠶農(nóng)的消毒防病意識,促使其掌握消毒的技術(shù)要點,選擇有效的消毒藥物和科學(xué)的消毒方法。消毒方法如下[2]:①用2%甲醛溶液在25℃的環(huán)境溫度下保持濕潤狀態(tài)20 min;②用0.3%漂白粉溶液在23 ℃的環(huán)境溫度下保持3 min;③用0.5%石灰漿在23 ℃的環(huán)境溫度下保持3 min進行消毒,均可滅活BmDNV或先用1%的新鮮石灰漿消毒再用含有效氯1%的漂白粉液或2%甲醛溶液進行消毒能有效的抑制濃核病及其他蠶病的發(fā)生和傳播[12]。

    3.2.2 加強桑園與飼養(yǎng)管理,增強蠶兒體質(zhì) 首先因地制宜選擇桑樹品種,做好肥水管理,根據(jù)各齡期采摘適熟葉,保證蠶兒營養(yǎng)需求,加強蠶室內(nèi)氣象環(huán)境控制,創(chuàng)造適溫適濕的飼養(yǎng)環(huán)境;其次要做好小蠶共育,共育出強健無毒的小蠶;再次由于桑螟、桑卷葉蛾是BmDNV的健康帶毒者[13],采取農(nóng)業(yè)防治與化學(xué)藥物相結(jié)合做好病蟲害防治,防止病原以桑葉作為媒介傳染家蠶。

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