生物絮團中微生物群落的功能、結(jié)構(gòu)及其調(diào)控研究進展

羅婉儀，雷澤湘，李義勇

（1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，廣州510225；2廣東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境污染防控工程技術(shù)研究中心，廣州510225；3仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣州510225）

0 引言

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)歷史悠久，是世界上最早實施水產(chǎn)養(yǎng)殖的國家，也是世界上唯一一個人工養(yǎng)殖量超過天然捕撈量的國家[1]。在人工養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖戶向養(yǎng)殖水體投加大量飼料，但因養(yǎng)殖動物的利用率較低，大量殘剩飼料和糞便在水體中積累，產(chǎn)生大量氮污染，造成水質(zhì)惡化，使養(yǎng)殖水體環(huán)境面臨日益惡化的挑戰(zhàn)[2]。為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)惡化等問題，生物絮團技術(shù)(Biofloc Technology，BFT)[3]被引入其中。BFT是一種限制水體交換，通過向養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加有機碳源，調(diào)節(jié)水體中的碳氮比(C/N)，促進水體中異氧細菌的繁殖，進而調(diào)控水質(zhì)的新興生態(tài)型水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)模式。該技術(shù)可凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)、減少換水次數(shù)、為養(yǎng)殖動物提供餌料蛋白源、降低飼料系數(shù)，并對養(yǎng)殖動物具有一定的生物防治作用[4-6]，目前，BFT在國內(nèi)的應(yīng)用已由試驗階段過渡至中試規(guī)模的養(yǎng)殖試驗[7-8]。

生物絮團是BFT的核心，是養(yǎng)殖水體中以異養(yǎng)微生物為主，通過生物絮凝作用將水環(huán)境中的有機質(zhì)、原生動物、藻類與絲狀菌等結(jié)合而成具有不規(guī)則外形的絮狀懸浮物[9-11]。生物絮團主要由不同的微生物菌群組成，它們在水產(chǎn)養(yǎng)殖中扮演著分解者和生產(chǎn)者的角色，也是其他營養(yǎng)水平較高的生物的食物來源，微生物菌群在物質(zhì)循環(huán)、水質(zhì)調(diào)節(jié)、疾病控制與維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著不可磨滅的作用[12-16]。生物絮團中的微生物種類復(fù)雜多樣，同時存在有益微生物和有害微生物，若通過調(diào)節(jié)有益微生物的種類和數(shù)量，使其在養(yǎng)殖水體中占主導(dǎo)地位，減少有害微生物的占比，即可強化生物絮團的功能，從而有利于BFT在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。另外，外界環(huán)境因素容易對生物絮團中的菌群種類及功能造成影響[17]，致使不同時間區(qū)域的生物絮團養(yǎng)殖模式的生物絮團的構(gòu)成具有差異性，使其難以定性定量分析。可見，深入探究生物絮團中的微生物群落結(jié)構(gòu)，對其特征及多樣性進行分析，有助于進一步了解BFT的本質(zhì)，也有助于其后續(xù)的人工調(diào)控。因此，本文以微生物群落為視角，總結(jié)歸納了生物絮團的功能、生物絮團的結(jié)構(gòu)和生物絮團的人工調(diào)控等三個方面的研究成果，為BFT的發(fā)展與應(yīng)用提供參考。

1 生物絮團的功能

生物絮團具有多重功能，其中主要功能包括凈化養(yǎng)殖水體、實現(xiàn)養(yǎng)殖對象的生物防治和提高飼料利用率等。

1.1 凈化養(yǎng)殖水體

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖對象的糞便及大量殘剩飼料含有較高的氮，當(dāng)這些物質(zhì)在水體中不斷積累，超出養(yǎng)殖水體的自然硝化作用，會導(dǎo)致氨氮和亞硝酸鹽氮等有害氮素在養(yǎng)殖水體中蓄積，當(dāng)濃度達到一定程度會對養(yǎng)殖對象的生長發(fā)育造成影響，嚴(yán)重時會造成死亡[18]。BFT通過向養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加有機碳源，調(diào)節(jié)水體碳氮比，促進水體中異氧菌的繁殖，異氧菌能直接吸收水體中的有害氮素并將其轉(zhuǎn)化為自身菌體蛋白，再通過被養(yǎng)殖動物攝食，從而將氮素從養(yǎng)殖水體中去除，起到凈化水質(zhì)的作用[19]。異養(yǎng)菌生長代謝能力強，其同化氨氮的速度約為硝化細菌的10倍[20]，有研究表明，在C/N為10時，10 mg/L的氨氮能在5 h內(nèi)完全被生物絮團內(nèi)的微生物同化，使氨氮得以完全去除，而不會產(chǎn)生硝酸鹽和亞硝酸鹽[21]。胡修貴等[22]從對蝦生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)中篩選出了食物鹽單胞菌和勝利鹽單胞菌兩株具有高氨氮轉(zhuǎn)化率的菌株，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C/N達到28時，食物鹽單胞菌對氨氮的去除率達到85.53%；當(dāng)C/N為21時，勝利鹽單胞菌對氨氮的去除率高達90.7%。生物絮團作為微生物豐度和多樣性都較高的菌群聚合體，具有不同脫氮功能的菌體，能有效轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖水體中的有害氮素，達到凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的目的。

1.2 實現(xiàn)養(yǎng)殖對象的生物防治

與傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式相比，BFT因換水量少，切斷了致病菌通過換水進入養(yǎng)殖水體的通道，有效降低外源致病菌入侵養(yǎng)殖水體的可能性，降低了養(yǎng)殖對象的患病率，保護了養(yǎng)殖對象。同時，生物絮團上的益生菌與弧菌等病原菌爭奪生長所需的營養(yǎng)元素，及爭奪養(yǎng)殖對象體表上的生態(tài)位點，從而抑制病原菌增殖，起到了生物防治作用[23]。高磊等[24]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比控制在10以上時，水體中的芽孢桿菌和乳酸菌對弧菌的生長有明顯的拮抗作用。此外，生物絮團中的假單胞菌、芽孢桿菌等細菌可產(chǎn)生聚-β-羥基丁酸(PHB)等可提高養(yǎng)殖對象抵抗病毒能力的物質(zhì)，降低受細菌感染的可能性[25]；絮團中細菌及藻類的某些胞外代謝產(chǎn)物可造成病原菌的群體感應(yīng)紊亂，促使毒性信號分子失活，保護了養(yǎng)殖對象的生長穩(wěn)定[26]?？梢?，生物絮團通過阻斷病原菌進入養(yǎng)殖系統(tǒng)、競爭病原菌的營養(yǎng)與生態(tài)位點、發(fā)揮拮抗作用、供給活性物質(zhì)提高養(yǎng)殖動物免疫力、及產(chǎn)生代謝物誘導(dǎo)病原菌失活等綜合效應(yīng)，實現(xiàn)了對養(yǎng)殖對象的立體保護。

1.3 提高飼料利用率

生物絮團中的異養(yǎng)菌能將水體中的有害氮素轉(zhuǎn)化成自身菌體蛋白，經(jīng)過養(yǎng)殖動物對絮團顆粒的攝食，降低飼料系數(shù)，節(jié)約養(yǎng)殖成本[8]，為養(yǎng)殖系統(tǒng)提供了一個額外的廉價飼料供應(yīng)源。Avnimelech等[27]曾以13C為標(biāo)記，探究生物絮團的可食性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)細菌轉(zhuǎn)化后的絮團成分最終在羅非魚的組織中富集。進一步將BFT應(yīng)用于羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)飼料利用率達到45%，飼料系數(shù)顯著下降[3]。隨后，Burford等[28]用15N追蹤對蝦攝食絮團的情況，發(fā)現(xiàn)對蝦日常攝食中的氮有18%～29%來自于絮團。可見，生物絮團中的碳素和氮素都實現(xiàn)了循環(huán)利用，最終提高了飼料利用率。

2 生物絮團的結(jié)構(gòu)

生物絮團中的微生物是其發(fā)揮特定功能的決定因子，而微生物群落結(jié)構(gòu)的改變影響著生物絮團的功能。Crab等[29]較早研究了羅非魚雜交種越冬池塘中的絮團菌群變化情況，并采用PCR-DGGE技術(shù)構(gòu)建DGGE圖譜，分析了微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。該研究雖未對生物絮團的微生物種類進行鑒定分析，但為生物絮團群落結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。自此，養(yǎng)殖水體中的生物絮團的菌群結(jié)構(gòu)受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

2.1 生物絮團形成過程分析

夏耘等[30]研究了草魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物絮團培育的第5、10、15天的菌群結(jié)構(gòu)的變化過程，結(jié)果顯示，生物絮團培養(yǎng)過程中的主要優(yōu)勢菌為α-變形菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱和擬桿菌綱，且不同時段的特異菌均不同，培育第5天出現(xiàn)氣單胞菌、土壤桿菌和食酸菌；培育第5～10天為β-變形菌和擬桿菌；培養(yǎng)到第10天出現(xiàn)芽孢桿菌；培養(yǎng)到第15天出現(xiàn)特異菌紅球菌屬。據(jù)此，可將生物絮團的形成分為三個階段：0～5天為開始階段，5～15天為形成階段，15～30天為穩(wěn)定階段[31]。盛建海[32]利用高通量測序分析凡納濱對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物絮團形成初期（0～15天）的菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢菌門為變形菌門和厚壁菌門；主要菌綱為γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱；優(yōu)勢菌屬為微小桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和Ramlibacter。生物絮團正是依靠著豐富的微生物菌群及其協(xié)同與競爭作用，最終形成穩(wěn)定的生態(tài)位群落結(jié)構(gòu)，使其功能得到穩(wěn)定發(fā)揮，使該技術(shù)受到了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的信任和青睞

2.2 優(yōu)勢菌種分析

Zhao等[33]分析了日本囊對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中形成的生物絮團菌群，發(fā)現(xiàn)絮團中主要菌群為變形菌和芽孢桿菌，而芽孢桿菌成為優(yōu)勢菌可能是與該養(yǎng)殖過程中添加了枯草芽孢桿菌類益生菌劑有關(guān)。楊章武等[34]在凡納濱對蝦育苗系統(tǒng)中培育生物絮團，發(fā)現(xiàn)絮團主要優(yōu)勢菌為擬桿菌門和變形菌門。廖栩崢等[35]在室外構(gòu)建凡納濱對蝦生物絮團養(yǎng)殖池，發(fā)現(xiàn)絮團在門水平上，變形菌門占比最高，藍細菌門占比最低，而在科水平上，紅桿菌科占比最高。任利華等[15]發(fā)現(xiàn)仿刺參苗種培育池中生物絮團的優(yōu)勢菌群為黃桿菌綱、α-變形菌綱和芽孢桿菌綱，其中，黃桿菌綱是該水體中的絕對優(yōu)勢菌群?？梢?，當(dāng)前關(guān)于生物絮團優(yōu)勢菌種的解析仍大多數(shù)停留在門和綱的水平，深入到種屬水平的報道較為有限。更深層次地了解絮團中的優(yōu)勢種屬及其特定功能，特別是掌握絮團中的優(yōu)勢種屬的變化規(guī)律，將有助于準(zhǔn)確評估生物絮團性能，提高其在養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應(yīng)用效果，并為對其實施精準(zhǔn)的人工調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

3 生物絮團的人工調(diào)控

養(yǎng)殖環(huán)境條件既能直接影響?zhàn)B殖對象的生理狀態(tài)，也能對養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)造成重大影響，而后者又會對前者造成間接影響。通過改變碳源類型、碳氮比、溫度、pH和溶解氧等條件，可以實施對微生物群落結(jié)構(gòu)的人工調(diào)控，使之朝著有利于養(yǎng)殖對象健康生長的方向發(fā)展。

3.1 碳源種類的人工調(diào)控

生物絮團中異養(yǎng)微生物的生長繁殖依賴于養(yǎng)殖水體中的氮素與所添加的碳源。不同類型的碳源不僅可以影響生物絮團的形態(tài)，而且在更深層次上決定生物絮團的群落結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性[36-37]。Wei等[38]比較了葡萄糖、淀粉和甘油等3種碳源對絮團微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)3種碳源培育的絮團優(yōu)勢菌門均為變形菌門與擬桿菌門，且淀粉組的優(yōu)勢菌有藍藻細菌。張哲等[39]比較了葡萄糖、淀粉和蔗糖等3種碳源的影響，也發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌均為變形菌門和擬桿菌門；同時，使用生物絮團飼養(yǎng)對蝦有利于提高其存活率，且葡萄糖組的對蝦成活率最高。研究還發(fā)現(xiàn)，部分類型的碳源可抑制致病菌的侵害[9]。例如：向養(yǎng)殖水體中投加蔗糖、木薯渣和酶解木薯渣等培育生物絮團，發(fā)現(xiàn)酶解木薯渣組絮團中的益生菌相對豐度比另外兩組高，且在對蝦腸道中前10個優(yōu)勢菌種中致病菌所占比例較另外兩組低，說明以酶解木薯渣作為碳源既有利于益生菌的繁殖，又有效抑制致病菌，促進了對蝦健康生長[40]?？梢?，選擇合適的碳源有助于實現(xiàn)對生物絮團的正向調(diào)控，提高養(yǎng)殖效率。

3.2 碳氮比的人工調(diào)控

碳和氮是微生物生長所需的基本元素，兩者的水平直接影響了微生物的生長繁殖能力[20]。生物絮團的核心是通過調(diào)控水體中的碳氮比，人為控制生物絮團的形成[41]。研究表明，碳源利用率與氨還原能力之間的關(guān)系取決于系統(tǒng)中合適的C/N平衡，非洲鯰魚系統(tǒng)中去除營養(yǎng)性污染物的最佳C/N為15，此時水體中氨氮的去除率達到98.7%，且生物絮團濃度達到92.5mL/L[42]。通過建立模型，得出當(dāng)養(yǎng)殖水體中碳氮比為15.75時，有利于異養(yǎng)微生物的繁殖，促進微生物合成菌體蛋白，有效降低養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽氮濃度。研究認(rèn)為，不同C/N時，去除養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮所依靠的主力軍有所不同；當(dāng)養(yǎng)殖水體中的C/N較低時，主要通過自養(yǎng)微生物及浮游藻類；當(dāng)C/N為8～10時，主要依靠自養(yǎng)微生物和異養(yǎng)微生物的共同作用；當(dāng)水體中的C/N＞15時，主要是異養(yǎng)微生物為主導(dǎo)[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖時間的延長，不同C/N水平下養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢菌群及其含量的差異越來越明顯[43]。值得指出的是，高磊等[20]結(jié)合益生菌和致病菌進行研究，發(fā)現(xiàn)較高C/N水平有利于芽孢桿菌和乳酸菌的生長，有效抑制了弧菌生長。Panigrahi等[44]研究也獲得了類似的結(jié)論?？梢姡x擇合適的碳氮比是實現(xiàn)生物絮團正向調(diào)控的又一關(guān)鍵性因素。

3.3 溫度的人工調(diào)控

溫度會影響各種微生物的生長代謝，從而對微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響[45]。羅金飛等[46]研究了水體溫度（18、22、26、30和32℃）對擬穴青蟹循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)各溫度水體在門水平上的優(yōu)勢菌種相同，均為變形菌門和擬桿菌門，但各溫度下的相對豐度有所差異，即在30℃下變形菌門相對豐度最高，在26℃下最低，而擬桿菌門與之相反，在30℃下相對豐度最低，26℃下最高，且認(rèn)為水溫是通過影響?zhàn)B殖水體中的營養(yǎng)鹽含量而改變了水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)。王志寶等[47]則認(rèn)為水溫影響了生物絮團中中肋骨條藻等構(gòu)成藻的生長，進而在很大程度上決定了生物絮團的基礎(chǔ)維度，即生物絮團的發(fā)育與形成，但具體作用機制有待進一步研究。

3.4 pH的人工調(diào)控

在生物絮團系統(tǒng)中，堿度和pH下降是一個不可避免的問題。在生物絮團形成過程中，異養(yǎng)細菌的同化作用及硝化細菌的硝化作用都需要利用氨氮化合物，消耗大量的堿度，所產(chǎn)生的CO2溶于水造成水體pH下降；另外，硝化作用的過程中會產(chǎn)生酸性代謝物，也進一步促使水體pH下降；而生物絮團系統(tǒng)在運行過程中為零換水或少換水狀態(tài)，必然導(dǎo)致養(yǎng)殖水體pH明顯下降，進而會抑制異養(yǎng)菌和硝化菌的功能，使水體中氨氮積累，造成水質(zhì)惡化[48]。有學(xué)者[49-50]比較了pH 6.5、7.5、8.5對生物絮團氨氮轉(zhuǎn)化效率的影響，均發(fā)現(xiàn)pH 6.5組的氨氮向有機氮轉(zhuǎn)化效率顯著低于pH 7.5和pH 8.5組，說明pH對絮團的氮素轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。Zhang等[51]利用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體至pH 7.6和pH 8.1，比較未調(diào)控水體pH及調(diào)控后對南美白對蝦絮團系統(tǒng)的生物絮團活性物質(zhì)積累和對蝦生長的影響，發(fā)現(xiàn)調(diào)控pH后的絮團系統(tǒng)中PHB含量顯著高于未調(diào)控組，且pH 8.1組的PHB含量最高；同時，pH 8.1組的對蝦生長情況優(yōu)于其他兩組。可見，pH值會影響生物絮團的氮素轉(zhuǎn)化和胞內(nèi)物積累，從而影響?zhàn)B殖對象的生長。

3.5 溶解氧的人工調(diào)控

生物絮團中異養(yǎng)微生物生長通常需要氧氣，但不同微生物種類對溶解氧濃度的適應(yīng)能力有所不同，導(dǎo)致不同溶解氧條件下存在不同的微生物菌群結(jié)構(gòu)[52]。王朋等[53]探究了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中溶解氧濃度對微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)日均溶氧濃度達到2.5 mg/L時，微生物菌群豐度能達到最高水平。同時，溶解氧水平還會在一定程度上影響微生物菌群的有機物去除效率。當(dāng)溶解氧濃度過低時，不利于硝化作用的進行，容易導(dǎo)致氨氮積累，造成水體富營養(yǎng)化，而溶解氧濃度過高，也會對硝化作用產(chǎn)生抑制效果；當(dāng)DO濃度為5.0～7.0 mg/L時，水體處理效果最優(yōu)，不僅氨氮去除率達到78.7%，而且COD和SS去除率也達到較高水平[54]。

4 展望

BFT作為新興生態(tài)型水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)模式，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，且在理論研究上已取得一定成果，但在以下方面還值得進一步開展深入研究與探索：

（1）生物絮團的功能主要是通過異養(yǎng)微生物實現(xiàn)的，而異養(yǎng)微生物種類多樣，作用各異，現(xiàn)階段仍有許多異養(yǎng)微生物的類型及功能有待探索，因此有必要系統(tǒng)地研究主要發(fā)揮作用的菌種，且深入研究它們相互間的協(xié)同或拮抗作用，目標(biāo)在于提高有益菌占比，使之成為優(yōu)勢種群，更好地在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)揮作用。

（2）生物絮團系統(tǒng)中微生物豐度和多樣性較高，但對于微生物菌群研究現(xiàn)階段主要是到屬水平，而種水平上的研究寥寥可數(shù)，對種屬的動態(tài)變化更是知之甚少，使生物絮團的精準(zhǔn)調(diào)控難以實現(xiàn)，因此有必要借助最新的高通量測序技術(shù)手段更深入解析生物絮團的種屬組成。

（3）在傳統(tǒng)養(yǎng)殖過程中，由于室外的天氣因素不可控，缺乏對溫度、pH和溶解氧等環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)影響的探討，而隨著工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，有必要加強這方面研究，以通過綜合的、更微小的環(huán)境因子調(diào)節(jié)實現(xiàn)對微生物群落精準(zhǔn)調(diào)控的目標(biāo)，為工廠化養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)和提供關(guān)鍵工藝參數(shù)指導(dǎo)。

隨著水產(chǎn)品需求不斷擴大，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨轉(zhuǎn)型升級。BFT的發(fā)展與應(yīng)用，有利于節(jié)約水資源與保護水環(huán)境，降低養(yǎng)殖生產(chǎn)成本和疾病風(fēng)險，提高水產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，為中國水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色健康可持續(xù)發(fā)展提供有力支撐。