馬鈴薯致病疫霉拮抗細菌研究進展

高夢穎，付海燕,4，孫 叢，王顏波，劉春光，馬玉堃，楊峰山

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080；4東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心 150040）

0 引言

馬鈴薯致病疫霉是馬鈴薯種植生產(chǎn)中最重要的病害之一，曾經(jīng)給馬鈴薯種植業(yè)造成了毀滅性的危害[1]。1845年愛爾蘭因馬鈴薯致病疫霉導(dǎo)致馬鈴薯絕產(chǎn)，造成了100萬人死亡，馬鈴薯致病疫霉的防控成為了科學(xué)家和種植者的一個挑戰(zhàn)[2-3]。傳統(tǒng)對馬鈴薯致病疫霉的防治措施是以大量噴施化學(xué)殺菌劑為主[4]，而化學(xué)藥物的濫用亂用易導(dǎo)致環(huán)境污染并產(chǎn)生藥物殘留，且隨時間的推移，殺菌劑會在病原體中建立抗藥性，使馬鈴薯致病疫霉極易產(chǎn)生抗藥性和變異[5-6]。此外，殺菌劑對有益生物如固氮細菌、菌根真菌等產(chǎn)生不利影響[7]，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成不可逆的傷害，這與當今社會追求綠色環(huán)保的理念相違背。而且馬鈴薯致病疫霉在不同的生境條件會產(chǎn)生侵染力強，破壞性大的不同生理小種，使病菌基因型和小種組成便得更為復(fù)雜，進而導(dǎo)致現(xiàn)有得馬鈴薯品種喪失抗病性[8]。尋找環(huán)境友好型管理方式已迫在眉睫，田間管理、培養(yǎng)良種、生物防治相繼被提上日程，然而各地氣候條件存在差異，導(dǎo)致不同地區(qū)馬鈴薯致病疫霉的發(fā)病規(guī)律不同，使得田間管理在實施過程中存在很多不足，難以形成統(tǒng)一定論。而馬鈴薯致病疫霉會產(chǎn)生侵染力強，破壞性大的生理小種，使病菌基因型和小種組成變得更為復(fù)雜，導(dǎo)致原有的馬鈴薯品種喪失抗病性，且培育良種又存在耗時長，研究進展慢的問題。

在此大背景下，尋找優(yōu)良的馬鈴薯致病疫霉治理方法已成為當務(wù)之急。以合理預(yù)測預(yù)報預(yù)防、環(huán)境友好的生物防控技術(shù)為主的綜合防控方法是目前馬鈴薯病害研究防控的主要方向，生物防治具有高效低毒、安全環(huán)保等眾多優(yōu)勢，現(xiàn)已逐步成為植物病害防治的有效途徑之一[9]。運用微生物拮抗菌進行生物防治，達到平衡病原菌致病性和致病力是目前國內(nèi)外病害防治研究的熱點領(lǐng)域，也是防治馬鈴薯致病疫霉生物農(nóng)業(yè)研發(fā)的主要途徑[10]。

查閱近年來相關(guān)文獻時可以發(fā)現(xiàn)真菌、細菌、放線菌等均被發(fā)現(xiàn)具有拮抗馬鈴薯致病疫霉的能力，其中因細菌的種類繁多、繁殖快等特點更容易被發(fā)現(xiàn)和研究，在細菌類拮抗菌中以芽孢桿菌、假單胞菌和粘細菌為主。但是在對馬鈴薯致病疫霉拮抗菌的研究中以簡單的拮抗菌篩選與鑒定為主，對拮抗菌抑菌活性物質(zhì)、抑菌機理機制以及田間生產(chǎn)應(yīng)用方面研究較少。本研究較為系統(tǒng)的介紹了國內(nèi)外的馬鈴薯致病疫霉拮抗細菌的研究進展，分析歸納主要拮抗細菌的拮抗效果及拮抗物質(zhì)，并指出拮抗菌領(lǐng)域存在的一些問題，以期對深入探索研究拮抗菌的抑菌能力貢獻微薄之力。

1 馬鈴薯致病疫霉致病機制研究

1.1 馬鈴薯致病疫霉致病菌特性

馬鈴薯致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)de Bary)屬于卵菌綱鞭毛菌亞門霜目疫霉科疫霉屬真菌[11]。寄主種類少，僅侵染馬鈴薯、番茄及其他50個茄屬植物。

目前世界已發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯致病疫霉的交配型分為5種：A0交配型、A1交配型、A2交配型、A1、A2交配型和自育型[12]。馬鈴薯致病疫霉生活史同時包括無性和有性兩個階段，其中無性生殖階段是維持遺傳的穩(wěn)定性和病原菌侵染馬鈴薯階段，而有性生殖是在田間馬鈴薯致病疫霉交配型多，且病原菌無性生殖無法正常進行的條件下發(fā)生侵染[13]。

1.2 馬鈴薯致病疫霉的傳播方式及侵染過程

馬鈴薯致病疫霉多發(fā)生于夏秋多雨的氣候條件下，孢子囊可通過風、雨水、灌溉水進行傳播?？梢栽诔睗裢寥乐须S水分擴散而轉(zhuǎn)移[14]，或通過起壟、耕作等田間農(nóng)事活動被帶到地表，遇到雨水濺到植株下部葉片上。馬鈴薯致病疫霉產(chǎn)生的孢子囊可將多核的細胞質(zhì)分割成單核游動孢子，并在宿主的組織上生成附著包。附著包會產(chǎn)生一根胚芽管，該胚芽管可通過氣孔進入葉片和莖[15]，侵染葉片形成中心病株。中心病株的氣生孢子囊可通過空氣傳播或隨雨水灌溉進行擴散，逐漸形成發(fā)病中心。嚴重時，馬鈴薯致病疫霉會導(dǎo)致全田植株發(fā)黑變苦，并伴隨特殊臭味[16]。在馬鈴薯致病疫霉侵染植株的過程中，游動孢子的萌發(fā)是病害傳播最重要的形式，所以，應(yīng)從限制游動孢子的釋放，孢子囊和游動孢子的萌發(fā)方面來阻斷馬鈴薯致病疫霉的發(fā)生和傳播。

2 馬鈴薯致病疫霉拮抗菌的主要種類及拮抗物質(zhì)

2.1 芽孢桿菌

芽孢桿菌屬由于其在各種環(huán)境中的優(yōu)勢、恢復(fù)力和生存能力，以及它潛在能夠產(chǎn)生的生物活性分子的數(shù)量，是生物控制方法中的合適候選菌。自20世紀30年代中期以來，屬于芽孢桿菌屬的細菌，一直被用于生物防治策略。從那時起，人們對芽孢桿菌的興趣與日俱增，并發(fā)現(xiàn)了許多顯著的農(nóng)業(yè)應(yīng)用[17]。芽孢桿菌屬的馬鈴薯致病疫霉拮抗菌有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、美麗短芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，且隨著研究的深入進展，將會有越來越多芽孢桿菌屬拮抗菌會被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

枯草芽孢桿菌因其具有高拮抗作用而被學(xué)者廣泛發(fā)現(xiàn)和研究，王游游等[18]發(fā)現(xiàn)一株對馬鈴薯致病疫霉有高拮抗作用的菌株——枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WL2，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液抑菌帶寬均大于26 mm，對馬鈴薯致病疫霉菌絲體致畸率達到38.7%，在該菌株最低菌液濃度(1×104cfu/mL)抑制下，釋放游動孢子、孢子囊直接萌發(fā)和游動孢子萌發(fā)比率都是最低，依次為33.8%、28.3%和35.4%，此外WL2菌株在離體葉片和塊莖上的相對保護率分別為81.2%和80.5%。枯草芽孢桿菌(B.subtilis)WL2具有產(chǎn)脂肽的能力，可產(chǎn)生伊枯草菌素A和枯草菌表面活性劑兩類脂肽物質(zhì)。脂肽物質(zhì)對馬鈴薯致病疫霉均有一定的抑制作用[19]；Caulier等[20]在對芽孢桿菌對馬鈴薯致病疫霉的抑制作用中也發(fā)現(xiàn)了由枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌存在編碼伊枯草菌素、豐原素和表面活性蛋白家族脂肽的遺傳決定簇，產(chǎn)生的伊枯草菌素和豐原素家族的生物表面活性劑作為脂肽具有直接的抗真菌和抗卵菌活性。脂肽物質(zhì)對馬鈴薯致病疫霉有顯著的預(yù)防和治療效果，其中預(yù)防效果明顯優(yōu)于治療效果；此外脂肽可顯著促進馬鈴薯塊莖PPO、POD和PAL3種生防酶活性的提高且對馬鈴薯植株的生長有一定的促進作用，可促進植株葉綠素總含量提高，使根和莖的增粗增重，促進后代子薯增產(chǎn)[21]。

同時，Bhimanagoud等[22]研究了枯草芽孢桿菌MTCC-2422(T-3)、枯草芽孢桿菌KU936344(T-4)、枯草芽孢桿菌KU936345(T-5)和枯草芽孢桿菌KU936341(T-6)4株在大田條件下對馬鈴薯致病疫霉的生物防治效果。這些菌株產(chǎn)生霉菌毒素對抗病原微生物，細菌處理顯著降低了馬鈴薯致病疫霉的發(fā)病率。

短小芽孢桿菌可產(chǎn)生纖維素酶。而馬鈴薯致病疫霉菌絲的細胞壁主要由纖維素和葡聚糖及少量的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成[23]，卵菌能侵染植物的條件是細胞壁中纖維素的合成和存在[24]，微生物產(chǎn)生的纖維素酶可明顯的抑制其孢子囊的形成[25]，進而降低其對植物的侵染能力。張荷花等[26]發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌W-7在一定條件下同馬鈴薯致病疫霉對峙培養(yǎng)時和除菌過濾后的無菌體發(fā)酵液對馬鈴薯致病疫霉菌絲的抑制率大為不同，前者高達94.44%，而后者僅66.67%，兩者之間顯示出極顯著差異(P＜0.01)；而且二者之間在引起馬鈴薯致病疫霉菌絲體畸變方面也表現(xiàn)出極顯著差異，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，W-7在黑麥培養(yǎng)基中馬鈴薯致病疫霉對峙培養(yǎng)時受其誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶，并通過該酶抑制了馬鈴薯致病疫霉菌絲的生長，同時引起菌絲體的畸變[26]。

Caulier等[20]發(fā)現(xiàn)有14株芽孢桿菌對馬鈴薯致病疫霉有很好的抑制作用(GIP≥50%)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的強烈抑制作用可能與一些短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的桿菌溶素有關(guān)。桿菌溶素可以抑制真菌甘露蛋白和幾丁質(zhì)生物合成且具有抗菌活性，因為它是葡萄糖胺合成酶的抑制劑，會干擾細菌肽聚糖的生物合成[27]。

除此之外，芽孢桿菌菌株是誘導(dǎo)系統(tǒng)耐藥的潛在誘導(dǎo)子，可以降低疾病嚴重程度，其中解淀粉芽孢桿菌在這方面起的作用尤為突出。經(jīng)解淀粉芽孢桿菌處理的馬鈴薯植株的防御相關(guān)酶如過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性較高，導(dǎo)致總酚的積累量高于未處理對照植株。Keerthana等[28]從茄科農(nóng)作物馬鈴薯，番茄和龍葵的根際土壤中發(fā)現(xiàn)了解淀粉芽孢桿菌FZB 24菌株對馬鈴薯致病疫霉有較強的抑制作用，F(xiàn)ZB 24顯示出對馬鈴薯致病疫霉的最大抑制作用為35.56%?；诖顺醪胶Y選，F(xiàn)ZB 24分別在溫室和田間條件下又用于對馬鈴薯致病疫霉的進一步管理。溫室研究表明，以玉米粉配方配制的解淀粉芽孢桿菌粉劑(FZB 24)為葉噴劑，比對照組顯著降低了49.7%的馬鈴薯致病疫霉的嚴重程度。在田間條件下，解淀粉芽孢桿菌(FZB 24)處理的馬鈴薯小區(qū)馬鈴薯致病疫霉嚴重程度顯著降低，塊莖產(chǎn)量高于對照產(chǎn)量。

2.2 假單胞菌

假單胞菌是一個基因和表型多樣的革蘭蛋白桿菌屬的成員。與植物相關(guān)的假單胞菌表現(xiàn)出顯著的代謝多價性，確保了根際和葉際的適應(yīng)性和競爭力，在根際和葉際，假單胞菌與宿主形成致病性、共生或互惠關(guān)系[22]，現(xiàn)已被研究用于對抗由真菌、細菌和卵菌引起的害蟲和植物疾病。其中一些假單胞菌菌株通過釋放揮發(fā)性化合物和通過擴散非揮發(fā)性代謝物在體外造成病原體生長的強烈減少[29]。

Mout De Vrieze等[30]對9株具有高拮抗作用的假單胞菌測序菌株進行基因組學(xué)分析，對菌株的表型特征及其綜合基因庫的比較分析表明，多種化合物和機制可能參與了對馬鈴薯致病疫霉的抑制、植物定殖和與其他微生物的競爭。他們的分析確定了幾株拮抗菌來解釋菌株的抗致病疫霉活性和馬鈴薯定殖能力，其中包括HCN、參與幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)降解以及纖維素生物合成的酶、環(huán)脂肽、可能作為ABC轉(zhuǎn)運體輔助成分的脂蛋白、胞外多糖、鐵載體、細菌素和其他毒素以及不同的分泌系統(tǒng)。

Caulier等[20]發(fā)現(xiàn)假單胞菌產(chǎn)生的環(huán)脂肽(CLPS)具有直接的抗真菌和抗卵菌活性，可以使暴露于其中的游動孢子完全固定化和隨后的溶解。其作用機制與芽孢桿菌脂肽一樣，是游動孢子膜的增溶作用。他們篩選出的5株具有抗感染活性的假單胞菌中，有3株具有參與脂肽生物合成的遺傳決定因子，且假單胞菌產(chǎn)生的一些脂肽，以及由芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性劑和豐原素家族的脂肽，具有在植物中觸發(fā)ISR的間接拮抗活性，假單胞菌在體內(nèi)外能產(chǎn)生生物表面活性劑和鐵載體，它們的真菌毒性是通過質(zhì)膜中的孔隙形成機制介導(dǎo)。

藍希鉗等[31]從土壤中分離出一株假單孢菌20#-5菌株，其發(fā)酵液或發(fā)酵液甲醇浸提物含有多種活性成分，對馬鈴薯致病疫霉的菌絲在平板上的生長有明顯抑制效果[32]。Hunziker等[33]發(fā)現(xiàn)了一株假單胞菌(Pseudomonasspp.)的活體細胞及細胞懸浮液對馬鈴薯致病疫霉菌絲的生長有很強的抑制作用，抑制率高達90%以上，其中揮發(fā)性物質(zhì)1-十一碳烯是從懸浮液中分離的活性拮抗成分，該物質(zhì)能顯著的抑制馬鈴薯致病疫霉菌絲體的生長及孢子囊的發(fā)育，抑制率達60%以上。Zegeye等[34]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)Bak150菌株對馬鈴薯致病疫霉菌絲也具有顯著抑制作用，且抑制率達88%以上。

2.3 粘細菌

粘細菌作為革蘭氏陰性真細菌，是具有社會性行為，可以改變形態(tài)并通過感應(yīng)營養(yǎng)細胞間傳遞的信號進行滑動，群體捕食等[35]。粘細菌還可以產(chǎn)生數(shù)量多，結(jié)構(gòu)新穎，種類豐富，作用層次高且機制復(fù)雜的次生代謝物，其對馬鈴薯致病疫霉的抑制在最近幾年也被當作熱門話題進行研究討論。

武志華[36]通過研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古中部地區(qū)83%的粘細菌菌株對馬鈴薯致病疫霉具有抑制作用，其中以粘球菌屬(Myxococcus)和珊瑚狀珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)兩個屬的抗病菌株比例高。他篩選分離的黃色粘球菌B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)可有效抑制馬鈴薯致病疫霉的無性生殖和有性生殖，降低馬鈴薯致病疫霉菌體可溶性蛋白的含量和菌體保護酶(PPO、POD、SOD)的活性，增加細胞膜的氧化損傷和通透性。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，兩種菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)中拮抗組分均含有甲基（2R）-2-疊氮基-3-羥基-2-丙甲酯和氮-（3-氨基-2-羥丙基）-氮-甲基硫酸二胺兩種物質(zhì)。

任興波等[37]篩選分離出了抗馬鈴薯致病疫霉菌株黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)YR-7和變綠粘球菌（Myxococcusvirescens）YR-35，菌絲生長抑制效果達到了96.67%，其中黃色粘球菌YR-7的發(fā)酵產(chǎn)物對菌絲的抑制率達50.90%，它產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可以有效的抑制馬鈴薯致病疫霉侵染馬鈴薯葉片；其團隊分離出的變綠色粘球菌對馬鈴薯致病疫霉菌絲的生長具有抑制作用，抑制率達96.67%，拮抗活性物質(zhì)在30～80℃處理1 h后菌絲生長抑制率達21.70%，大于80℃后活性下降，90℃時抑制率仍達15.38%?；钚晕镔|(zhì)在pH 5.0～9.0條件下抑制率保持在25.27%以上，當pH＜5.0或pH＞9.0時，活性物質(zhì)的抗菌活性明顯下降[38]。

丁一秀[39]團隊發(fā)現(xiàn)弱小珊瑚球菌(Corallococcus exiguous)、匣狀粘球菌(Pyxidicoccusfallas)和珊瑚狀珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)對馬鈴薯致病疫霉有顯著的抑制作用。

3 展望

在日益追求生態(tài)環(huán)保的現(xiàn)在，化學(xué)殺菌劑終將會被拋棄，而轉(zhuǎn)基因食品安全又存在爭議，拮抗菌的研究和推廣前景一片大好。目前對馬鈴薯致病疫霉拮抗菌的研究有很多，各種類拮抗菌層出不窮，但仍然存在一些研究深度及應(yīng)用問題。

（1）國內(nèi)對于馬鈴薯致病疫霉的微生物防治研究大多停留在拮抗菌對馬鈴薯致病疫霉各個發(fā)育階段的抑菌效果這些表型層面，未來需要從分子層面深入剖析拮抗菌的抑制機理機制，從源頭上尋找對馬鈴薯致病疫霉的抑制方法和對策，這對拮抗菌規(guī)模化產(chǎn)業(yè)化和廣泛化應(yīng)用也具有一定的幫助。

（2）很多拮抗菌在實驗室條件下的抑菌效果非常顯著，而在大田條件下的抑菌效果卻不盡人意，這使得大部分拮抗菌的實際應(yīng)用性能得不到保障，若能模擬大田條件進行多對一模式的多種菌在同一平板上同時和病原菌進行對峙實驗，則可能篩選出在復(fù)雜條件下依然穩(wěn)定拮抗的拮抗菌，且這種篩菌模式會大大減輕科研人員的工作量，甚至會批量產(chǎn)出高性能的拮抗菌。

（3）國內(nèi)大部分對馬鈴薯致病疫霉拮抗菌的研究只關(guān)注其拮抗能力，但對其定植能力、應(yīng)用后對作物的根際菌群影響方面的關(guān)注較少，未來可在研究拮抗菌的同時研究這兩方面的影響，使拮抗菌可以更好得到應(yīng)用。