高效液相色譜法測定磷酸吡哆醛中維生素B6及其有關(guān)物質(zhì)

陳 健 ,陳奀飛 ,王 莉 ,盛 力 ,沈大冬 ,韓忠耀

(1.浙江醫(yī)藥股份有限公司研究院,紹興 312500;2.黔南民族醫(yī)學高等專科學校,都勻 558000)

磷酸吡哆醛(PLP)是維生素B6(VB6)的主要輔酶活性形式,參與多種氨基酸代謝轉(zhuǎn)化[1-2],其結(jié)構(gòu)式見圖1。其中,涉及氨基酸多種反應(yīng),在代謝轉(zhuǎn)換、物質(zhì)合成中發(fā)揮著極為重要的作用[3]。PLP 既可以作為藥物用于臨床,促進轉(zhuǎn)氨作用提高體內(nèi)多巴胺的含量[4],進而用于治療帕金森綜合征[5];也可以作為其他原料藥的起始物料,用于合成β-羰基酰胺類藥物等研究[6]。

圖1 PLP的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of PLP

PLP一般以VB6為原料合成[7-8],因此,在PLP質(zhì)量研究中,VB6(已知雜質(zhì))和其有關(guān)物質(zhì)(未知雜質(zhì))的含量測定具有十分重要的意義。長久以來,起始物料的質(zhì)量控制在原料藥注冊技術(shù)要求中一直有著舉足輕重的地位,人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(ICH)及各國藥審監(jiān)督機構(gòu)相繼出臺相關(guān)技術(shù)要求予以規(guī)范。目前,對于PLP 的研究,主要以合成工藝改進、生物代謝轉(zhuǎn)化[9-10]及臨床治療[11-12]居多,對于其質(zhì)量控制的相關(guān)研究鮮有報道。

本工作應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)建立了PLP中VB6及其有關(guān)物質(zhì)含量測定的方法,為PLP質(zhì)量標準的建立,提供更為科學的試驗依據(jù)和方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配紫外檢測器(VWD)、二極管陣列檢測器(DAD)和Agilent Open Lab CDS2.3色譜工作站;XS205型分析天平;S220型pH 計。

磷酸二氫鉀-1-庚烷磺酸鈉緩沖溶液:稱取0.85 g磷酸二氫鉀和3.0 g 1-庚烷磺酸鈉,溶于1 L水中,并用三氟乙酸調(diào)節(jié)溶液pH 至3.0。

稀釋劑:稱取磷酸氫二鉀4.33 g溶于1 L水中,作為試驗中配制溶液的稀釋劑備用。

PLP對照品儲備溶液:2.50 g·L-1,稱取PLP對照品50.0 mg于20 mL容量瓶中,用稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

VB6對照品儲備溶液:62.5 mg·L-1,稱取VB6對照品12.50 mg于200 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP對照品溶液:5.00 mg·L-1,稱取PLP 對照品12.50 mg于25 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。移取該溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

VB6對照品溶液:2.52 mg·L-1,稱取VB6對照品6.30 mg于25 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。移取該溶液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP供試品溶液:0.5 g·L-1,稱取PLP 供試品約25 mg于50 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。

PLP 對照品(批號:100855-200701,純度為99.3%),VB6對照品(批號:100116-201705,純度為100.0%);PLP供試品(來自3家公司,批號分別為170803H、20191015、AR1930N01);磷酸二氫鉀(純度為99%),磷酸氫二鉀(ACS 級),1-庚烷磺酸鈉(純度為99.5%),三氟乙酸(純度為99.9%),乙腈(純度不小于99.9%);試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測波長294 nm;流量0.9 mL·min-1;柱溫47 ℃;進樣量5μL;流動相:A 為磷酸二氫鉀-1-庚烷磺酸鈉緩沖溶液,B為乙腈。梯度洗脫:初始A為100%,保持13 min;13～25 min時,A 由100%降至80%,保持10 min。

1.3 試驗方法

移取一定量的待測液(對照品溶液或供試品溶液),按色譜條件進樣測定,記錄目標物峰面積。采用外標法定量,以峰面積計算VB6含量,其他未知雜質(zhì)使用主成分對照法計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

分別移取PLP 對照品儲備溶液2 mL 和VB6對照品儲備溶液0.4 mL,置于同一個10 mL容量瓶中,加稀釋劑稀釋至刻度,搖勻。于色譜條件下進樣測定,所得色譜圖見圖2。

圖2 PLP和VB6對照品混合溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the mixture solution of PLP and VB6reference

由圖2可見:PLP 和VB6可以完全分離,相互之間無干擾,方法具有良好的專屬性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相、流量和柱溫

根據(jù)查閱文獻可知,可使用HPLC測定VB6的含量[13-15]。由于PLP 是一種非常重要的維生素B族化合物[16],且為極性較強的兩性化合物,因此使其和有關(guān)物質(zhì)均在色譜體系下得以合適的保留,成為方法建立的關(guān)鍵。在方法建立初期,本研究根據(jù)PLP的化合物結(jié)構(gòu)以及合成工藝中潛在雜質(zhì)分析,首先考察了流動相分別為烷基磺酸鹽和四烷基銨鹽離子對試劑時對各組分分離的影響。結(jié)果顯示:VB6在四烷基銨鹽為流動相的色譜體系下,難以保留。因此,試驗選用烷基磺酸鹽中含碳鏈較長的庚烷磺酸鈉鹽(1-庚烷磺酸鈉)作為流動相A 相,同時用三氟乙酸和磷酸二氫鉀將pH 調(diào)節(jié)至酸性,使PLP和VB6中的氮原子均帶正電荷,與離子對試劑緊密結(jié)合,再通過柱溫以及流量的優(yōu)化調(diào)整,使PLP中的VB6以及其他雜質(zhì),均有良好的保留時間和較好的分離度,優(yōu)化后的色譜條件見1.2節(jié)。

2.2.2 檢測波長

PLP和其他雜質(zhì)最大吸收波長為294 nm,VB6最大吸收波長為292 nm,通常紫外波長檢測允許誤差范圍為±2 nm,因此,結(jié)合PLP、VB6和其他雜質(zhì)的紫外吸收情況(圖3)及流動相噪聲背景等,試驗選擇檢測波長為294 nm,經(jīng)方法驗證,在該波長下檢測方法具有良好的穩(wěn)健性。

圖3 PLP和VB6紫外吸收全波長光譜圖Fig.3 UV absorption full wavelength spectrograms of PLP and VB6

2.3 標準曲線和檢出限

配制PLP和VB6對照品溶液系列,按色譜條件進樣測定。以PLP 和VB6的峰面積為縱坐標,兩者的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線,所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算PLP 和VB6檢出限(3S/N);以10倍信噪比計算PLP和VB6測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

表1 PLP和VB6的線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits,and lower limits of determination of PLP and VB6

2.4 方法的精密度

稱取PLP供試品25 mg于50 mL 容量瓶中,向其中加入VB6對照品儲備溶液2 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,平行配制6份,按色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示:6份供試品溶液中VB6的平均質(zhì)量分數(shù)為0.48%,相對標準偏差(RSD)為0.92%;其他未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.39%,1.71%,RSD 分別為2.8%,1.5%。

另一分析員,在不同日期使用不同儀器,重復(fù)平行配制上述溶液6份,按色譜條件進行測定。結(jié)果顯示:6份溶液中VB6的平均質(zhì)量分數(shù)為0.54%,RSD 為0.89%;其他未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.47%,1.82%,RSD 分別為2.5%,1.3%。表明在該色譜體系下,測定PLP 中的VB6含量及其有關(guān)物質(zhì)具有較好的重復(fù)性。

2.5 回收試驗

稱取9份PLP供試品25 mg于50 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,作為空白VB6供試品溶液。按照ICH Q2B[17]中范圍的要求,每3份空白供試品溶液作為一組,3組供試品分別在高、中、低3個水平的加標量下加入VB6對照品,按色譜工作條件進樣測定,每份重復(fù)測定5次,計算VB6的回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表2。

由表2可知:VB6的回收率為99.5%～102%,該方法可準確定量PLP中VB6的含量。

2.6 方法的穩(wěn)健性

固定其他色譜條件,分別改變色譜條件中的流量和柱溫兩個條件,以考察方法的穩(wěn)健性。稱取PLP供試品25 mg于50 mL容量瓶中,向其中加入VB6對照品儲備溶液2 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,平行配制6份,考察流量為0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1,柱溫為46 ℃和48 ℃時,供試品中各組分質(zhì)量分數(shù)的變化情況,結(jié)果見表3。

表2 回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of test of recovery(n＝5)

表3 方法的穩(wěn)健性試驗結(jié)果Tab.3 Results of test for robustness of the method

由表3可知:流量和柱溫的小幅度變化,VB6、其他雜質(zhì)和總雜質(zhì)的檢測結(jié)果基本一致。表明該方法具有良好的穩(wěn)健性。

2.7 樣品分析

取來自3個生產(chǎn)廠家的不同批號的PLP 供試品溶液、VB6對照品溶液和PLP 對照品溶液,按試驗方法測定其中VB6及其他有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù),結(jié)果見表4;VB6對照品溶液和其中批號為170803 H 的供試品溶液色譜圖見圖4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of samples %

圖4 VB6對照品溶液和PLP供試品溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of VB6reference solution and PLP sample solution

本工作建立的高效液相色譜檢測方法,可以更準確地測定PLP 中VB6和其他未知雜質(zhì)的含量,且方法的靈敏度高、重復(fù)性好、專屬性強,可為PLP的質(zhì)量標準建立提供參考。