缺血再灌注損傷下微囊泡抑制心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

常冀楊 孟曉菲 周佳奇 黃開越 張清潭

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，山東 256600

隨著人口老齡化，心肌組織的缺血再灌注損傷（如心肌梗死、心力衰竭）已被公認(rèn)為是導(dǎo)致死亡的重要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，到2020年，缺血性心臟病將成為最常見的致死性疾病之一［1］?；謴?fù)血液再灌注可有效減少缺血性心臟損害，但值得注意的是，心肌組織的血液供應(yīng)恢復(fù)后常發(fā)生心肌再灌注損傷，并可能引起不可逆的損害［2］。目前已知的缺血再灌注損傷的可能機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等［3-4］，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。凋亡作為細(xì)胞程序性死亡方式之一，目前被認(rèn)為是細(xì)胞缺血再灌注損傷中最為重要的分子機(jī)制。而凋亡的發(fā)生同樣依賴于許多病理生理過程，如炎癥、氧自由基的增加、線粒體損傷等。研究者們過去常常關(guān)注上述病理機(jī)制，希望從中尋求新的治療思路。然而近十年來，最新研究發(fā)現(xiàn)微囊泡同樣也參與了缺血再灌注所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且在其中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生凋亡時(shí)，微囊泡將從不同類型的細(xì)胞質(zhì)膜中釋放出來。同時(shí)，微囊泡可以傳遞信號(hào)，并作為介導(dǎo)細(xì)胞通訊的系統(tǒng)信使誘發(fā)一系列細(xì)胞形態(tài)和（或）功能改變［5］，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，細(xì)胞的凋亡不完全基于缺血再灌注損傷的直接刺激，受刺激的細(xì)胞可以通過釋放微囊泡間接作用于正常的外周細(xì)胞，從而進(jìn)一步促進(jìn)周圍其他的細(xì)胞凋亡［6］。換言之，在微囊泡的參與下，可放大細(xì)胞凋亡。然而令人驚訝的是，在某些特定條件下，微囊泡的增多可抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其保護(hù)作用［7］，且這一作用越來越受到關(guān)注。本篇綜述中，我們概括了微囊泡在細(xì)胞缺血再灌注損傷中的形成及特征，進(jìn)一步總結(jié)了微囊泡抑制心肌細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制，并初步歸納了微囊泡在缺血再灌注相關(guān)的心臟疾病中的作用，為缺血性心臟病的治療提供了新思路。

1 微囊泡與缺血再灌注損傷

1.1 微囊泡 微囊泡是一類直徑在100～1 000 nm的球形結(jié)構(gòu)分子［8］，通過質(zhì)膜出芽釋放出的可以表達(dá)原始細(xì)胞特有的抗原磷脂囊泡。盡管先前研究將微囊泡作為惰性碎片，認(rèn)為其形成代表著一種生理現(xiàn)象，但是越來越多的試驗(yàn)證據(jù)表明，多種病理過程與微囊泡的顯著增加有關(guān)。微囊泡可被各種類型的細(xì)胞所釋放，并且根據(jù)所釋放細(xì)胞來源和狀態(tài)而在成分上有所不同。例如，在細(xì)胞損傷、炎癥、血栓形成和血小板活化期間，外周血中循環(huán)的微囊泡數(shù)量會(huì)顯著增加［9］。目前研究表明，微囊泡通常在外界刺激下形成于質(zhì)膜內(nèi)富含脂質(zhì)的微區(qū)中［10］，如細(xì)胞內(nèi)鈣超載可以觸發(fā)微囊泡的形成，隨后磷脂進(jìn)行不對(duì)稱重排［11-12］，膜破裂后可激活鈣敏感酶，從而促使膜蛋白脫離細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，最后形成微囊泡［13］。其中，凋亡型微囊泡的形成關(guān)鍵取決于Rho相關(guān)激酶ROCK I，其在凋亡過程中通過半胱天冬酶介導(dǎo)的裂解而被激活［9］。ROCK I可以激活肌球蛋白輕鏈的磷酸化和肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白絲與質(zhì)膜的偶聯(lián)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排至微囊泡的形成。盡管我們尚未完全準(zhǔn)確了解微囊泡形成的確切機(jī)制及各種細(xì)胞群體之間所釋放的微囊泡類型不同的原因，但由此可以推測(cè)，細(xì)胞骨架重組或代表了微囊泡的形成關(guān)鍵步驟。隨著越來越多相關(guān)試驗(yàn)的進(jìn)展，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微囊泡能夠攜帶大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及各種核酸（例如RNA和DNA），使微囊泡可以通過將具有生物活性的分子轉(zhuǎn)移到周圍細(xì)胞來介導(dǎo)細(xì)胞間的“交流”。正由于微囊泡參與了不同的生物學(xué)過程，由微囊泡介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，包括細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)。例如，張磊［14］證實(shí)了從人類胚胎神經(jīng)干細(xì)胞釋放的微囊泡通過介導(dǎo)高表達(dá)的熱休克蛋白70有效抑制了心肌細(xì)胞凋亡。此外，經(jīng)該類微囊泡干預(yù)后可增加內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)增殖［15］。除了攜帶蛋白質(zhì)之外，由于微囊泡富含諸如鞘磷脂、磷脂等脂質(zhì)，因此微囊泡具有比原始細(xì)胞更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。存在于微囊泡表面的溶血性磷脂酰膽堿（LPC）與循環(huán)免疫球蛋白M耦聯(lián)，進(jìn)而與凋亡細(xì)胞結(jié)合，使微囊泡與凋亡細(xì)胞一起被清除［16］。迄今為止，對(duì)微囊泡所釋放的不同類型的RNA的研究較為廣泛。其中，對(duì)微小RNA（miRNA）的研究最多。一項(xiàng)大鼠模型的研究表明，微囊泡能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子傳遞至受體細(xì)胞并轉(zhuǎn)化其表型［17］。在腫瘤細(xì)胞系中，微囊泡治療降低了癌細(xì)胞生存能力、增加了癌細(xì)胞的凋亡水平，并降低了B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白的表達(dá)及線粒體膜電位［18］。Rhodes等［19］研究表明，微囊泡中攜帶miRNA含量可能因疾病而異。一方面，他們發(fā)現(xiàn)與患有穩(wěn)定性冠心病患者相比，微囊泡增強(qiáng)了急性冠脈綜合征患者中促炎性miRNA（miR-19、miR-21、miR-146、miR-155和miR-223）的表達(dá)水平。另一方面，源自內(nèi)皮前體干細(xì)胞的微囊泡可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，以上過程正是由于微囊泡攜帶促血管生成的miRNA引起的［20-21］。綜上所述，正是由于既能夠參與細(xì)胞之間的通訊以維持生理平衡，又能協(xié)助介導(dǎo)傳遞體內(nèi)誘導(dǎo)疾病的信號(hào)，我們可以將微囊泡看作是成為未來各類疾病的潛在治療手段。

1.2 微囊泡與心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷 心肌細(xì)胞的缺血再灌注是許多心血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，如心肌梗死和心力衰竭。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注后心肌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制之一。在缺血再灌注損傷下，微囊泡在缺血再灌注損傷過程中數(shù)量增加，可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、白細(xì)胞黏附、血小板活化等現(xiàn)象。已有多項(xiàng)試驗(yàn)證明了經(jīng)微囊泡處理干預(yù)后會(huì)顯著加重心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷［22］及血管內(nèi)皮功能障礙［23］。值得注意的是，微囊泡作為一把“雙刃劍”，在缺血再灌注損傷中的所發(fā)揮的作用不盡相同，不僅取決于其釋放細(xì)胞的微環(huán)境，而且還取決不同的細(xì)胞來源［24］。Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn)由缺血條件下心肌細(xì)胞釋放的微囊泡顯著減少了心肌梗死的面積和凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量，從而驗(yàn)證了微囊泡的保護(hù)作用。此外，有研究表明miR-22攜帶的間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微囊泡可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷［25］。而人類胚胎神經(jīng)干細(xì)胞可以釋放攜帶熱激蛋白70的微囊泡，這類微囊泡的釋放也可以起到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用［14］。由于釋放細(xì)胞的微環(huán)境、攜帶物質(zhì)的種類和來源細(xì)胞的差異，微囊泡的功能均有所不同。在缺血再灌注損傷中，微囊泡不僅顯示出促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，更顯示出保護(hù)性心肌細(xì)胞的作用。因此，在缺血后再灌注期間攜帶大量“信號(hào)貨物”而被釋放出的微囊泡與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

2 微囊泡抑制缺血再灌注條件下心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

大量研究表明，在缺血再灌注損傷體內(nèi)、外模型中，微囊泡均可通過不同的機(jī)制抑制凋亡從而發(fā)揮保護(hù)作用［26］，而這一發(fā)現(xiàn)有望使微囊泡在缺血性心臟疾病的治療上成為一種新型治療方法。在此，我們總結(jié)了微囊泡抑制缺血再灌注條件下心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為不同蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的生物合成場(chǎng)所，為細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持和凋亡提供了主要區(qū)域［27］。在細(xì)胞應(yīng)激條件下，包括缺血再灌注損傷、缺氧等，都可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，也就是眾所周知的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［28-29］。越來越多的證據(jù)表明，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)可以在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中被激活應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件［30］。GRP78作為主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，是未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，心肌細(xì)胞中GRP78經(jīng)缺血再灌注誘導(dǎo)可激活心肌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺血再灌注損害［31］。在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，來自缺血預(yù)處理后釋放的微囊泡被證實(shí)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)在缺血再灌注條件下的心肌細(xì)胞凋亡存在抑制作用。經(jīng)缺血預(yù)處理后，研究人員檢測(cè)到心肌細(xì)胞中半胱天冬酶3、9、12的活性也顯著下降，而且TUNEL染色顯示陽性細(xì)胞核的百分比和數(shù)量均降低。通過蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)，在經(jīng)缺血預(yù)處理后釋放的微囊泡能夠使GRP78的表達(dá)明顯上調(diào)［32］。還有其他研究也闡述了微囊泡可以降低細(xì)胞凋亡程度，然后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑控制了GRP78的表達(dá)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。另外，血小板所釋放的微囊泡也被證實(shí)參與了大鼠后肢經(jīng)缺血再灌注預(yù)處理的心臟保護(hù)作用，經(jīng)預(yù)處理后的血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、大鼠后肢細(xì)胞釋放出的微囊泡均能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少細(xì)胞的凋亡［33］。此外，研究表明，在缺血再灌注損傷期間，缺血的心肌細(xì)胞釋放的微囊泡可顯著減少心肌梗死的面積，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減少心肌細(xì)胞的凋亡。與試驗(yàn)組相比，缺血再灌注后心肌細(xì)胞所釋放微囊泡治療組的肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）活性明顯降低。同時(shí)，半胱天冬酶12作為一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)的公認(rèn)的標(biāo)志物，在心肌中的表達(dá)也同樣顯著降低［7］。維持鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能也同樣至關(guān)重要。眾所周知，心肌缺血再灌注損傷可引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)一步致心肌損傷甚至細(xì)胞凋亡。大量研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中鈣的濃度主要取決于網(wǎng)狀Ca2+-ATP酶（SERCA2），此外，p-PLB是SERC2的調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化形式。SERCA2與細(xì)胞中鈣濃度的調(diào)節(jié)緊密相關(guān)，它可將鈣從細(xì)胞的胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。有試驗(yàn)表明，在凋亡過程中正常心肌功能受損并伴有SERCA2表達(dá)降低時(shí)，更多的鈣離子會(huì)滯留在胞質(zhì)中［34］。研究表明，在經(jīng)微囊泡治療后，GRP78、SERCA2和p-PLB的表達(dá)顯著增加［7］。綜上所述，心肌細(xì)胞釋放的微囊泡通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)鈣穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮保護(hù)作用，從而抑制缺血再灌注損傷中的心肌細(xì)胞凋亡。

2.2 miRNA易位途徑 過去被視為細(xì)胞碎片的miRNA，隨著近些年來研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)其參與了各種生理和病理過程，目前在科研界受到極大的關(guān)注。有研究表明從內(nèi)皮干細(xì)胞釋放的微囊泡可以攜帶miRNA從而抑制細(xì)胞凋亡。例如，通過轉(zhuǎn)運(yùn)保護(hù)性miRNA，如miR-126和miR-296，微囊泡降低了細(xì)胞受缺氧（缺血）的影響，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷［20］。眾所周知，急性心肌缺血/再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步導(dǎo)致左心室重構(gòu)和進(jìn)行性心力衰竭。多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）起源于重新分化的體細(xì)胞，目前正作為基于干細(xì)胞療法的一種極有發(fā)展前景的手段受到人們的廣泛關(guān)注。Wang等［7］研究證明，可以在心肌細(xì)胞中明顯觀察到多能干細(xì)胞釋放的微囊泡抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。此外，分別由Nanog和低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）調(diào)節(jié)的心臟保護(hù)性miR-21和miR-210在多能干細(xì)胞釋放的微囊泡中高度富集，并能夠被有效傳遞至心肌細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，微囊泡通過抑制缺血性心肌細(xì)胞中半胱天冬酶3、7的活化而顯著減少了心肌細(xì)胞的損傷，這在一定程度上是攜帶特定的miRNA（例如miR-21和miR-210）的保護(hù)結(jié)果［35］。Yu等［25］研究結(jié)論也支持類似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)由微囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的miR-221/222在間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)增高，可相對(duì)保護(hù)更多細(xì)胞免于凋亡。綜上所述，以上結(jié)論證明了心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是由miR-221介導(dǎo)的，而該保護(hù)序列部分由間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的微囊泡所轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 缺血再灌注相關(guān)心臟病中的微囊泡

包括急性冠脈綜合征和心力衰竭在內(nèi)的缺血性心臟病仍是全世界死亡和致殘的主要原因之一［36］。研究表明，對(duì)缺血性心臟病最有效的治療方法之一是及時(shí)進(jìn)行再灌注治療。但是，再灌注會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌細(xì)胞損傷，通常被稱為是心肌缺血再灌注損傷。本綜述闡述了微囊泡在缺血再灌注損傷后釋放并觸發(fā)各種不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而影響細(xì)胞的凋亡。基于以上分子層面的研究，已有研究者將此應(yīng)用于缺血再灌注體外模型，并發(fā)現(xiàn)微囊泡可發(fā)揮一定的保護(hù)作用。例如，Giricz Z等證實(shí)缺血再灌注損傷大鼠中經(jīng)缺血預(yù)處理心肌細(xì)胞產(chǎn)生的微囊泡治療后可以減少心肌梗死的面積。另外一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，Zhou等［37］還證實(shí)了在接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）后的ST段抬高型心肌梗死患者中，來自各種細(xì)胞來源的微囊泡水平與變化的時(shí)程不盡相同。試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCI后微囊泡的水平顯著增加，并且在48 h達(dá)峰值，這表明微囊泡的增多可能在PCI術(shù)后患者的心臟中也發(fā)揮保護(hù)性的作用。此外，微囊泡的治療還可以用于檢測(cè)藥物的臨床療效。例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的微囊泡水平的升高可反映血管內(nèi)皮損傷，研究提示與應(yīng)用10 mg阿托伐他汀相比，40 mg阿托伐他汀可以降低缺血性心臟病患者循環(huán)內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放微囊泡的水平，這表明循環(huán)中微囊泡的顯著下降與內(nèi)皮功能的改善密切相關(guān)。同時(shí)，有研究指出，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于促凋亡狀態(tài)時(shí)，可能會(huì)破碎成微囊泡，故血管內(nèi)皮細(xì)胞水平的降低可能是由于其微囊泡脫落所致，也增加了除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素外的主動(dòng)脈的硬化程度［38］。因此受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和其釋放的微囊泡生產(chǎn)可能是導(dǎo)致缺血性損傷加重的機(jī)制。近年來的研究和臨床試驗(yàn)已經(jīng)初步證實(shí)了微囊泡在缺血再灌注相關(guān)疾病中的重要作用，而這也為微囊泡作為靶向治療缺血性心臟病的新策略提供理論基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

本篇綜述主要概括了微囊泡在細(xì)胞缺血再灌注損傷中的形成及特征，并進(jìn)一步總結(jié)了微囊泡抑制心肌細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制，并初步歸納了微囊泡在缺血再灌注相關(guān)的心臟疾病中的作用。研究發(fā)現(xiàn)在缺血性疾病中，源自不同來源的微囊泡的釋放在疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。隨著缺血性心臟病成為人類目前主要的死亡原因之一，我們迫切需要針對(duì)缺血性心臟病患者的新型治療策略。微囊泡之所以引起了人們極大的興趣，正因?yàn)樗鼈冏鳛楦鞣N疾病的信號(hào)或生物標(biāo)志物，具備能夠?qū)⒍喾N蛋白質(zhì)或遺傳物質(zhì)遞送至心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的潛在治療價(jià)值。微囊泡已被證實(shí)參與心肌細(xì)胞缺血性損傷的調(diào)節(jié)，并且還保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。盡管近年來已經(jīng)有不少學(xué)者在研究微囊泡形成的機(jī)制，但微囊泡如何精確靶向特定組織仍有待商榷。雖然越來越多的證據(jù)展示了基于微囊泡的治療可以受到巨大獲益，但目前仍缺乏針對(duì)缺血性心臟病中微囊泡的實(shí)用價(jià)值研究。因此，作為缺血性心臟疾病治療可能的新方向，更多關(guān)注的重點(diǎn)在于進(jìn)行各種臨床試驗(yàn)以評(píng)估微囊泡作為缺血性心臟病的潛在治療方法的可行性。