椎間盤退變中自噬與凋亡的分子關(guān)系研究進(jìn)展

茅峰 劉建文 陳靜云 姜宏

椎間盤退變(IDD)是各種脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)，包括椎間盤突出癥，椎體滑脫，椎管狹窄等，也是導(dǎo)致慢性腰背痛(LBP)的一個(gè)重要原因[1-2]。一般認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的丟失，椎間盤細(xì)胞減少和炎癥反應(yīng)在椎間盤退變中起重要作用[3-4]。髓核細(xì)胞的減少是導(dǎo)致椎間盤退變的直接原因，隨著髓核(NP)細(xì)胞過度凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)合成減弱，導(dǎo)致正常椎間盤結(jié)構(gòu)和生理功能的破壞，進(jìn)而加重椎間盤退變[5-7]。近年來通過誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬來拮抗凋亡，延緩椎間盤退變，逐漸成為熱點(diǎn)[8-9]。本文綜述了最近幾年，椎間盤組織中凋亡及自噬的研究，重點(diǎn)指出兩者介導(dǎo)椎間盤退變過程中分子機(jī)制及相互串?dāng)_機(jī)制，為治療椎間盤退變提供新思路。

1 凋亡與椎間盤退變

1.1 凋亡分子機(jī)制

凋亡包含兩個(gè)核心途徑——死亡受體介導(dǎo)(外源性)途徑和線粒體依賴性(內(nèi)源性)途徑。外源性途徑是由腫瘤壞死因子受體(TNFRs)、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體(TRAILRs)和死亡受體(Fas等)激活引發(fā)的[10-11]。線粒體依賴性的內(nèi)源性途徑激活以線粒體外膜通透性(MOMP)為標(biāo)志[12]。

1.2 凋亡與椎間盤變性

髓核細(xì)胞過量的死亡導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成減少，這是椎間盤變性最明顯的生物學(xué)變化。此外，在椎間盤退變期間，促炎因子在髓核細(xì)胞中高表達(dá)，這些病理變化加劇了機(jī)體脊柱原有結(jié)構(gòu)破壞和生物力學(xué)變化[13-15]。內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑均在髓核細(xì)胞變性中起關(guān)鍵作用，有證據(jù)表明在凋亡的內(nèi)在途徑中機(jī)體主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2，Caspase-3，膠原蛋白和蛋白聚糖的水平參來與髓核細(xì)胞變性。在血清饑餓的情況下，髓核細(xì)胞過表達(dá)Bcl-2，細(xì)胞凋亡減少，Caspase-3 水平降低，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的mRNA水平升高[16]。線粒體功能障礙是ROS產(chǎn)生的主要原因，它的特征是線粒體質(zhì)量減少，呼吸鏈缺陷，線粒體膜通透性增加以及線粒體膜電位的降低，功能異常的線粒體會(huì)泄漏更多的電子以產(chǎn)生ROS。另一方面，ROS累積到一定程度，會(huì)以線粒體為標(biāo)靶發(fā)起攻擊，致使線粒體DNA和呼吸酶遭受氧化性損傷，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙。用H2O2處理的髓核細(xì)胞凋亡增加，檢測到蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA水平降低[17-18]。相反氧化還原輔助因子輔酶PQQ，可清除細(xì)胞中積聚的活性氧(ROS)并抑制細(xì)胞凋亡[19]。不僅如此，存在PQQ的情況下，盡管髓核細(xì)胞處于誘導(dǎo)凋亡環(huán)境中，仍可維持一定的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。在研究炎癥誘導(dǎo)椎間盤退變發(fā)病機(jī)理過程中，發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)下降，加入抗氧化劑后，IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤退變明顯受到了抑制[20-21]。

在椎間盤變性過程中，髓核細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)Fas等死亡受體介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。髓核細(xì)胞受到刺激后中，較低水平的miR-155即可以通過表達(dá)具有死亡域的Fas相關(guān)蛋白來靶向募集Caspase-3，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。如長非編碼RNA GAS5通過該途徑介導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和Caspase-3上調(diào)促進(jìn)椎間盤髓核細(xì)胞的凋亡。Qiu等[22]發(fā)現(xiàn)RIPK1的過表達(dá)可抑制TNF和Caspase-3活性，具有阻止或延緩椎間盤疾病變性潛力，因此可開發(fā)出毒性低的RIPK1來治療或延緩椎間盤退化。

2 自噬與椎間盤退變

2.1 自噬分子機(jī)制

自噬過程作為細(xì)胞生存機(jī)制受到AuTophaGy相關(guān)(ATG)蛋白嚴(yán)格調(diào)控，已發(fā)現(xiàn)的ATG基因編碼蛋白中，ATG5是目前被認(rèn)為對于自噬囊泡的形成是必不可少的，敲除或靶向抑制ATG5會(huì)導(dǎo)致自噬水平的下調(diào)或完全抑制[23-24]。雷帕霉素(mTOR)是一種機(jī)體必需的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)途徑的下游介質(zhì)，負(fù)調(diào)控自噬，細(xì)胞應(yīng)激后，mTORC1去磷酸化的導(dǎo)致自噬激活[25-28]。AMP激活蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞面對能量供應(yīng)缺失的中央調(diào)節(jié)器，AMPK的核心是通過調(diào)控mTORC1活性來影響自噬過程[29-30]。不僅如此，AMPK還可以通過增加ATG表達(dá)，提高自噬體膜結(jié)構(gòu)的募集[31]。Beclin-1基因同樣對于自噬至關(guān)重要，是延伸自噬體的脂質(zhì)膜，促進(jìn)被消除底物的募集和自噬體的成熟所必需的[32-33]。

2.2 自噬與椎間盤變性

自噬作為細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡機(jī)制存在于各個(gè)組織和器官的發(fā)育過程中，低水平的自噬在非退行性大鼠的髓核細(xì)胞中被觀察到，驗(yàn)證了自噬和椎間盤髓核細(xì)胞退變存在聯(lián)系[34]。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)自噬可能有助于髓核細(xì)胞維持外基質(zhì)(ECM)的代謝平衡。也有報(bào)告指出mRNA-129-5P的甲基化通過靶向Beclin-1調(diào)節(jié)椎間盤退變來調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞自噬，阻止了髓核細(xì)胞的凋亡[36]。Shen等[37]證實(shí)，IL-1β本身不會(huì)誘導(dǎo)纖維環(huán)(AF)細(xì)胞自噬，但當(dāng)血清剝奪誘導(dǎo)的自噬作用明顯增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞減少，證明了細(xì)胞的自噬作用可保護(hù)部分AF細(xì)胞免受凋亡。Zheng等[38]使用亞精胺促進(jìn)髓核自噬作為對抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制成功的改善椎間盤退變。在根據(jù)MRI確定的人類變性椎間盤的等級，檢查了重要的自噬通量標(biāo)志物L(fēng)C3和p62的表達(dá)。LC3-Ⅱ在Pfirrmann等級Ⅲ中表達(dá)最高，而其他等級的表達(dá)水平則明顯更低，而p62與椎間盤退變級別同向升高，直至Ⅴ級，從這些結(jié)果中我們可以看出，隨著Pfirrmann等級的升高自噬反應(yīng)逐漸減弱，甚至自噬功能障礙[39]。Miyazaki等[40]通過減少椎間盤髓核細(xì)胞營養(yǎng)供給誘導(dǎo)凋亡，而rhSIRT1阻止了這種凋亡并誘導(dǎo)了自噬，用抑制劑阻斷自噬后，觀測到細(xì)胞凋亡顯著增加，該實(shí)驗(yàn)證明rhSIRT1通過誘導(dǎo)自噬高表達(dá)而表現(xiàn)出抗凋亡作用。髓核細(xì)胞在遭受外界壓力刺激下，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平提高細(xì)胞存活率，從而改善椎間盤退變。然而在糖尿病患者的椎間盤退變實(shí)驗(yàn)中，在高葡萄糖濃度下，髓核、AF細(xì)胞自噬標(biāo)記物表達(dá)均隨著劑量和時(shí)間而增加，證實(shí)自噬與成年糖尿病患者椎間盤退變的潛存在正相關(guān)，預(yù)防自噬可被認(rèn)為是延緩成人糖尿病患者椎間盤變性的治療方案[41]。所以，自噬可能擁有決定細(xì)胞命運(yùn)的雙重作用，取決于響應(yīng)外部刺激時(shí)不同細(xì)胞內(nèi)途徑的激活和基因表達(dá)譜的特定變化。

3 自噬與凋亡在椎間盤退變中共同的分子機(jī)制

3.1 氧化應(yīng)激

ROS對髓核細(xì)胞的自噬與凋亡均有促進(jìn)作用。隨著椎間盤退變進(jìn)展，髓核細(xì)胞中線粒體質(zhì)量減少，線粒體呼吸增強(qiáng)，退化性椎間盤中過多的產(chǎn)生過多的ROS，使ROS在椎間盤細(xì)胞中生成與清除關(guān)系失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。ROS已經(jīng)被確定為在體外對髓核細(xì)胞的有效促細(xì)胞凋亡因子[43]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，抗氧化可以作為防止椎間盤細(xì)胞凋亡，增加椎間盤中細(xì)胞存活潛在措施。不僅如此，椎間盤細(xì)胞自噬過程同樣有ROS參與，已發(fā)現(xiàn)H2O2刺激大鼠髓核細(xì)胞通過ERK/mTOR信號通路激發(fā)下游效應(yīng)器進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的自噬。血清剝奪同樣引起的細(xì)胞中產(chǎn)生ROS，通過AMPK/mTOR信號通路促進(jìn)的自噬[44]。Bai等[45]認(rèn)為自噬可幫助椎間盤細(xì)胞清除過量ROS以及受損的細(xì)胞器等，減少髓核細(xì)胞凋亡，從而使椎間盤細(xì)胞在一定程度下氧化損傷中存活。然而，過多的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致自噬的過度激活，可能造成的椎間盤細(xì)胞自噬性死亡，加重椎間盤退變的進(jìn)程。

3.2 胱天蛋白酶

胱天蛋白酶對細(xì)胞自噬及凋亡均有調(diào)節(jié)作用，其作為細(xì)胞中的非活性前體存在，通過寡聚，調(diào)節(jié)前結(jié)構(gòu)域的裂解或與內(nèi)源性抑制劑的解離而被激活。胱天蛋白酶識別并切割多種ATG，導(dǎo)致自體吞噬功能的廢除，有利于體內(nèi)平衡偏向于凋亡[46-49]。然而，胱天蛋白酶介導(dǎo)的ATG的裂解并不總是沒有活性的產(chǎn)物，已經(jīng)顯示了幾種ATG片段具有新的活性，這些具有活性的新片段以多種方式影響凋亡和自噬，所以胱天蛋白酶也存在對自噬有促進(jìn)作用的可能[50-51]。已發(fā)現(xiàn)Caspase-1可能引起的LC3和Beclin-1的上調(diào)激活自噬[52]。Caspase-2控制線粒體ROS水平過防止ROS積累，導(dǎo)致mTORC的去磷酸化啟動(dòng)自噬。Caspase-3、6、8證明會(huì)切割A(yù)TG5和Beclin-1，其解離的Beclin-1片段具有促凋亡功能[53-55]。雖然胱天蛋白酶調(diào)節(jié)自噬的精確機(jī)制仍然未知，筆者認(rèn)為除非最初引起壓力的刺激力超過了閾值，否則大多數(shù)細(xì)胞在死亡之前將首先通過發(fā)自噬反應(yīng)來生存[56-57]。相反地，在過度自噬中，某些胱天蛋白酶可以通過降解ATG來充當(dāng)分子制動(dòng)器，以防止該過程達(dá)到無法恢復(fù)的地步，例如Caspass-8降解RIPK1，從而抑制自噬通量[58]?？傮w而言，由于胱天蛋白酶用對自噬的效應(yīng)似乎在很大程度上取決于微環(huán)境，因此需要進(jìn)一步的工作來描述椎間盤細(xì)胞面對外部刺激時(shí)自噬蛋白與凋亡蛋白之間的復(fù)雜關(guān)系。

3.3 Beclin-1基因

Beclin-1基因被證實(shí)與自噬基因Atg6同源，可以與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合物，募集胞漿中自噬體膜形成所需結(jié)構(gòu)蛋白，并引導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白結(jié)合于前自噬小體上，促進(jìn)自噬體成熟。Bcl-2和Bax是調(diào)控凋亡的主要蛋白，Beclin-1可以與抗凋亡蛋白Bcl-2直接結(jié)合形成新的聚合體，導(dǎo)致Beclin-1不能激活自噬[59]。促凋亡蛋白通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合，從蛋白聚合物中釋放Beclin-1，DAPK磷酸化Beclin-1，JNK磷酸化Bcl-2，自噬過程被激活，所以抗凋亡蛋白Bcl-2過表達(dá)可抑制自噬[60]。在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的凋亡中抗凋亡蛋白Bcl-2起著關(guān)鍵作用，主要通過與Beclin-1的結(jié)合，從而阻止了后者與Ⅲ型PI3K結(jié)合在自噬中的相互作用。腫瘤干細(xì)胞長時(shí)間暴露于Rottlerin中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(主要與抗凋亡蛋下調(diào)相關(guān))和自噬行為，Rottlerin誘導(dǎo)的自噬可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞死亡即自噬性死亡[61]。另外凋亡抑制自噬可以通過Caspase-3等對Beclin-1剪切功能，形成短的失活蛋白，進(jìn)而自噬被抑制。因此，凋亡與自噬之間相互作關(guān)系，可以通過對Beclin-1基因的進(jìn)行調(diào)節(jié)，這主要取決于擁有BH3結(jié)構(gòu)域蛋白之間的爭奪以及部分Caspase關(guān)鍵蛋白的相關(guān)活性。

4 小結(jié)與展望

目前臨床上使用藥物和物理療法可緩解大部分椎間盤退變所致的癥狀，但仍有不少患者因盤源性疼痛接受手術(shù)治療。在過去的10 a中，大量研究報(bào)告使人們對自噬和凋亡途徑有了深刻的理解，這些結(jié)論都驗(yàn)證了自噬與凋亡之間存在相互串?dāng)_、緊密聯(lián)系，提高椎間盤細(xì)胞的自噬水平減少椎間盤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而預(yù)防椎間盤退變的提供新方向。但是過度自噬也引發(fā)椎間盤細(xì)胞自噬性死亡，導(dǎo)致椎間盤退變加重，如何尋求自噬與凋亡之間的平衡則極為重要[62]。隨著對椎間盤退變中自噬與凋亡機(jī)制研究的越發(fā)深入，期待能夠從分子水平理解椎間盤細(xì)胞的自噬與凋亡關(guān)系，從而為延緩椎間盤退變的發(fā)展及臨床治療提供更有效的手段。