內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與異位骨化的研究進(jìn)展△

田 鵬，劉 軍，馬信龍

（天津市天津醫(yī)院，天津市河西區(qū)300211）

異位骨化（heterotopic ossification,HO）是指機(jī)體在沒(méi)有骨組織的軟組織內(nèi)出現(xiàn)新的骨形成的病理現(xiàn)象，主要原因包括創(chuàng)傷、神經(jīng)源性以及遺傳因素等［1，2］。創(chuàng)傷性HO常見(jiàn)于如關(guān)節(jié)周圍骨折、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后等［3］。神經(jīng)源性HO則與顱腦損傷、脊髓系統(tǒng)損傷相關(guān)［4］。遺傳性HO較少見(jiàn)，主要是進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良（fibrodysplasia ossificans pro?gressiva,FOP），患者可以終生出現(xiàn)進(jìn)行性HO，在肌肉組織中引起腫瘤樣腫脹，且出現(xiàn)急性炎癥過(guò)程周期性發(fā)作，并在炎性區(qū)域形成軟骨和骨［5］，但這一過(guò)程中的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。

近年來(lái)有關(guān)HO的發(fā)病機(jī)制取得一定的進(jìn)展，從最早的三因素學(xué)說(shuō)，即成骨前體細(xì)胞、成骨誘導(dǎo)刺激和適宜的骨形成組織環(huán)境；到最近的四因素學(xué)說(shuō)，即初始刺激因素、信號(hào)因子通路、未分化的干細(xì)胞和局部微環(huán)境，其發(fā)病機(jī)制逐步被掌握，但通過(guò)分析目前HO發(fā)病情況，可以發(fā)現(xiàn)HO的病理生理學(xué)機(jī)制和骨折愈合過(guò)程相似，這給創(chuàng)傷骨折患者在促進(jìn)骨折愈合及HO預(yù)防方面帶來(lái)了挑戰(zhàn)。

內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transi?tion,Endo-MT）是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesen?chymal transition,EMT）的特殊類型，其特征是細(xì)胞-細(xì)胞粘附喪失和細(xì)胞極性發(fā)生劇烈變化，從而產(chǎn)生長(zhǎng)梭形細(xì)胞，內(nèi)皮標(biāo)志物如CD31、VE-鈣粘蛋白、血管生成素受體-1（Tie-1）和血管性血友病因子（vWF）表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)記物如成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein 1,FSP-1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)增加。Endo-MT后形成的間充質(zhì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力，能夠在生理或病理?xiàng)l件下產(chǎn)生各種組織類型［6］。目前關(guān)于Endo-MT和HO的研究逐漸增多，本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于Endo-MT的特點(diǎn)、發(fā)生機(jī)制以及在HO中作用的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 Endo-MT的特點(diǎn)及在發(fā)育和疾病中的作用

Endo-MT是內(nèi)皮細(xì)胞在多種因素作用下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其被證實(shí)能夠促進(jìn)胚胎發(fā)育過(guò)程中心臟瓣膜和間隔的形成［7］，同時(shí)也被證實(shí)在某些病理?xiàng)l件下如心臟、腎和肺的纖維化［8］、腫瘤進(jìn)展［9］、以及傷口愈合過(guò)程中發(fā)揮作用。

內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)Endo-MT成為肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源，從而促進(jìn)臟器纖維化。同樣Endo-MT在靜脈移植后血管重塑過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。在腫瘤微環(huán)境中Endo-MT有助于形成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性外滲中發(fā)揮作用［11］。在機(jī)體受到損傷或產(chǎn)生炎癥后可能會(huì)激發(fā)這種機(jī)制從而在傷口愈合或纖維變性期間產(chǎn)生成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞形成瘢痕組織［12］。

2 Endo-MT與HO

最近有研究證實(shí)在HO小鼠模型中發(fā)現(xiàn)異位軟骨和骨細(xì)胞能夠表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物如Tie1、Tie2、vWF和VE-鈣粘蛋白，同樣FOP患者的HO病灶中約50%的軟骨和骨細(xì)胞能夠表達(dá)各種內(nèi)皮標(biāo)志物（Tie1、Tie2、vWF和VE鈣粘蛋白），來(lái)自正常的骨或軟骨組織的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞不表達(dá)這些內(nèi)皮標(biāo)志物［13］。探討血管內(nèi)皮細(xì)胞是如何轉(zhuǎn)化為異位軟骨及骨已經(jīng)成為了近來(lái)的研究熱點(diǎn)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞一般經(jīng)過(guò)Endo-MT成為成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)Endo-MT發(fā)生去分化后達(dá)到干細(xì)胞表型，然后可以分化為骨、軟骨或脂肪細(xì)胞。也有研究結(jié)果表明脂肪組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)發(fā)生Endo-MT變?yōu)榘咨妥厣炯?xì)胞［14］。探討導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育和病理衍生出其他細(xì)胞譜系的具體機(jī)制，是未來(lái)該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

也有學(xué)者提出參與異位骨形成的細(xì)胞不僅限于間充質(zhì)譜系的細(xì)胞，還有包括造血起源的循環(huán)細(xì)胞，在炎性組織中充當(dāng)成骨前體細(xì)胞，但是其具體轉(zhuǎn)化分子機(jī)制目前尚未完全清楚。有研究證實(shí)表達(dá)Tie-2的內(nèi)皮前體細(xì)胞能夠響應(yīng)周圍炎性反應(yīng)，通過(guò)軟骨內(nèi)途徑分化，且在HO形成過(guò)程中的每個(gè)階段都發(fā)揮作用［15］。其他的候選細(xì)胞可能是周細(xì)胞，駐留在肌肉組織內(nèi)干細(xì)胞也顯示出具有成骨的能力［16］。在進(jìn)行性骨化性肌炎中內(nèi)皮祖細(xì)胞可能有助于HO，而不是來(lái)自現(xiàn)有血管的成熟內(nèi)皮，內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)相同的標(biāo)志物，雖然比成熟內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)水平偏低［17］。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞可以被募集到早期FOP病變作為炎性反應(yīng)的一部分，并經(jīng)由Endo-MT促進(jìn)HO的形成。深入探究Endo-MT具體調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)HO的預(yù)防具有重要意義。

3 Endo-MT的相關(guān)信號(hào)通路

既然Endo-MT與HO形成有密切關(guān)系，因此需要明確Endo-MT的相關(guān)信號(hào)通路，尋找合適的分子靶點(diǎn)，為預(yù)防HO提供幫助。TGF-β和Notch信號(hào)通路是調(diào)節(jié)Endo-MT的常見(jiàn)因素，但是啟動(dòng)Endo-MT的是Notch通路還是TGF-β，亦或是兩者協(xié)同作用尚需要未來(lái)進(jìn)一步研究。另有Wnt信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、MicroRNAs、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等因素也可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β通路來(lái)影響Endo-MT的進(jìn)展。

3.1 TGF-β信號(hào)通路

TGF-β屬于多功能蛋白質(zhì)，其能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡。TGF-β誘導(dǎo)的Endo-MT需要兩種途徑包括Smad依賴性和Smad非依賴性信號(hào)通路。雖然抑制ALK2和ALK5都能抑制TGF-β誘導(dǎo)的Endo-MT，但是ALK2和ALK5下游信號(hào)通路不同，ALK2信號(hào)通過(guò)Smad1/5/8，然而ALK5信號(hào)通路通過(guò)Smad2/3［18］。也有研究證實(shí)抑制Smad4蛋白的表達(dá)能夠阻斷TGF-β2誘導(dǎo)的Endo-MT，同樣PI3K、MEK和p38 MAPK信號(hào)通路的化學(xué)抑制劑也能夠成功阻斷 TGF-β2誘導(dǎo)的 Endo-MT［19］。因此，抑制ALK2、ALK5或其幾個(gè)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路可能有助于阻止依賴Endo-MT的HO的形成。有研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TGF-β的響應(yīng)依賴TGF-β的劑量以及周圍微環(huán)境，觸發(fā)Endo-MT的信號(hào)通路可能在發(fā)育和病理?xiàng)l件之間變化［20］，因此，TGF-β誘導(dǎo)Endo-MT的具體機(jī)理需要進(jìn)一步探究。

3.2 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路幾乎影響所有細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，且在一系列生理以及病理過(guò)程中都發(fā)揮重要作用。Notch的受體和配體在造血干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的不同階段其表達(dá)存在差異，從而顯示Notch信號(hào)通路在細(xì)胞發(fā)育不同過(guò)程中作用也不同。細(xì)胞因子能夠影響造血干細(xì)胞的增殖和分化，但是具體分化方向受到細(xì)胞間相互作用的影響，而Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以作為細(xì)胞間相互作用的樞紐。

Notch和TGF-β類似，都能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生Endo-MT。Notch能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug以及ZEB1的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生En?do-MT。Notch信號(hào)能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Smad3 mRNA，穩(wěn)定Smad3蛋白，其與TGF-β因子能夠協(xié)同調(diào)控Endo-MT。有研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞間的接觸和激活Notch信號(hào)來(lái)促進(jìn)平滑肌的鈣化［21］。Notch信號(hào)能夠平衡內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生Endo-MT后的增殖和凋亡，其成分的突變可能導(dǎo)致人類主動(dòng)脈瓣先天性異常和瓣膜狹窄［22］。

3.3 Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路能夠介導(dǎo)多種生物學(xué)過(guò)程，如胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)以及維持干細(xì)胞的狀態(tài)。Wntβ-連環(huán)蛋白（β-catenin） 通路作為最經(jīng)典的通路，β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。有研究證實(shí)β-catenin能夠在細(xì)胞質(zhì)中聚集并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后結(jié)合TGF-β轉(zhuǎn)錄因子，然后激活Wnt靶基因，最終促使發(fā)生 Endo-MT［23］。

3.4 HIF-1信號(hào)通路

低氧誘導(dǎo)因子-1也是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中重要的調(diào)控因子，HIF-1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝，從而影響細(xì)胞增殖和分化，繼而影響人體的病理生理活動(dòng)。HIF-1介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧和缺血的代謝適應(yīng)，包括從氧化代謝向糖酵解的轉(zhuǎn)變。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，HIF-1保護(hù)胚胎不受宮內(nèi)缺氧的影響，若缺失或強(qiáng)制表達(dá)對(duì)胚胎是致命的。有研究證實(shí)HIF-1能夠通過(guò)活化TGF-β-R1/Smad信號(hào)通路繼而導(dǎo)致人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)輻射誘導(dǎo) Endo-MT［24］。

3.5 MicroRNAs與Endo-MT

近來(lái)研究關(guān)注到microRNAs與Endo-MT的關(guān)聯(lián)，證實(shí)microRNAs通過(guò)調(diào)控Endo-MT影響心血管的重塑、臟器纖維化和腫瘤等進(jìn)展。雖然Endo-MT和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有相似的過(guò)程，但是microRNA在調(diào)節(jié)Endo-MT具體機(jī)制目前尚不清楚，有研究證實(shí)miR-630能夠靶向轉(zhuǎn)錄激活因子Slug從而抑制Endo-MT減輕創(chuàng)傷后HO的形成［25］。也有學(xué)者證實(shí)NF-κB/miR-21/Smad7通路在1型糖尿病和糖尿病心肌病中調(diào)控Endo-MT過(guò)程，從而影響疾病的進(jìn)展，指出這可能是治療心血管性纖維化的潛在臨床治療靶點(diǎn)［26］。

3.6 VEGF

VEGF是重要促血管生成的生長(zhǎng)因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡作用，其能夠增加血管通透性以及促進(jìn)細(xì)胞遷移等。由于這些作用，它積極參與調(diào)節(jié)正常血管發(fā)育和病理血管生成。有研究證實(shí)了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在復(fù)雜的促血管生成和抗血管生成通路，包括TGF-β和VEGF/PLGF信號(hào)的交叉表達(dá)，這可能涉及不同靶細(xì)胞群中血管生成和Endo-MT的平行刺激［27］。最近研究發(fā)現(xiàn)VEGF也是Endo-MT的抑制劑，因?yàn)樗梢缘窒鸗GF-β2信號(hào)通路的效應(yīng)［28］，但是目前尚不清楚這種背景下VEGF的下游效應(yīng)器，當(dāng)前這些研究表明重組VEGF可能是HO的潛在抑制劑。

4 抑制Endo-MT的相關(guān)藥物

未來(lái)的研究應(yīng)該關(guān)注HO新的治療策略即如何抑制HO中Endo-MT介導(dǎo)的細(xì)胞分化。目前有關(guān)藥物抑制Endo-MT的方面，既有涉及HO領(lǐng)域的，也有尚未涉及HO方面的。Nintedanib［29］通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和平滑肌細(xì)胞增殖來(lái)改善實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓；甲氧基雌二醇能夠下調(diào)依賴HIF-1的Smad信號(hào)，從而抑制放射誘導(dǎo)的Endo-MT［24］；藤黃酸能夠通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)Endo-MT從而減少肺纖維化［30］；松弛素能夠通過(guò)Notch介導(dǎo)En?do-MT來(lái)抑制心臟纖維化［31］。AMP依賴的蛋白激酶抑制劑-Dorsomorphin和ALK2抑制劑LDN-193189能夠成功抑制小鼠的HO［32］。盡管帕羅伐汀在體外抑制了FOP幼齡小鼠的軟骨分化并降低了HO，但每日給藥可導(dǎo)致侵襲性滑膜關(guān)節(jié)過(guò)度生長(zhǎng)和長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板消融，這些結(jié)果反映了在骨骼成熟之前抑制病理性骨形成仍存在的挑戰(zhàn)［33］。

5 展望

Endo-MT在HO的病理過(guò)程中發(fā)揮核心作用，為預(yù)防HO提供新的策略和理論依據(jù)，這既是臨床工作者的挑戰(zhàn)也是臨床科研工作者努力的方向。