王玉梅 ,孫健,于泓,胡青,季申*
1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(上海 201203);
2.上海市食品藥品檢驗所,國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室(上海 201203)
獸藥殘留是指動物用藥后蓄積在動物體內(nèi)所有與藥物有關(guān)的物質(zhì)的殘留,包括藥物原型及其代謝產(chǎn)物。獸藥殘留不會隨著食品的加工而消失,而是會隨著食物鏈的積累而存在,不僅對環(huán)境有較大的污染,長期積累達到一定量時對人體也有較大的傷害[1-2]。
獸藥是動物養(yǎng)殖中不可或缺的投入品,可用來防治動物疾病、促進動物生長發(fā)育、改善產(chǎn)品質(zhì)量等。但一些不法商家為了快速謀取利益,不按說明書用藥,超范圍、超劑量、超療程地使用獸藥甚至違禁藥。這些行為將對靶動物安全、接觸者的安全、環(huán)境生態(tài)安全、動物性食品安全以及公共衛(wèi)生安全等都將構(gòu)成復(fù)雜而深刻的影響。因此,需要對獸藥殘留進行嚴(yán)格監(jiān)管,以此控制動物源性食品的安全和質(zhì)量,保障消費者的安全[3-4]。
當(dāng)前獸藥殘留檢測研究主要集中于食用動物及其內(nèi)臟、蛋、蜂產(chǎn)品、水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚蝦等。動物源性食品樣品基質(zhì)復(fù)雜,干擾多,需要簡便高效的前處理方法和靈敏度高、特異性強的檢測技術(shù)同時兼得。近年來,國內(nèi)外許多科研工作者都在這一領(lǐng)域取得了重大進展。對近年來動物源性食品的前處理方法和檢測技術(shù)進行綜述,以期為今后獸藥殘留檢測技術(shù)的發(fā)展提供一定的指導(dǎo)意義。
動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多且殘留量低,較農(nóng)產(chǎn)品的前處理技術(shù)更為復(fù)雜,分離純化難度大,屬于復(fù)雜基質(zhì)樣品中微量組分的檢測技術(shù)[5]。在完整的檢測實驗中,前處理工作耗時最長且最為關(guān)鍵,前處理的好壞直接影響實驗的精密度、準(zhǔn)確度[6]。
獸藥殘留前處理技術(shù)主要包括提取、分離、純化、濃縮和富集等。其中提取和純化是前處理步驟的關(guān)鍵,因其可以消除基質(zhì)干擾和保護色譜柱儀器。當(dāng)前,如何建立快速高效的樣品前處理技術(shù)已成為獸藥殘留前處理分析的發(fā)展方向和需要攻克的難關(guān)。近年來,文獻中報道的動物源性食品的樣品前處理技術(shù)主要包括液液萃取(LLE)法、免疫親和色譜(IAC)、固相萃?。⊿PE)法、QuChERS法等。
液液萃?。↙iquid-liquid extraction,LLE)是利用物質(zhì)在兩相系統(tǒng)分配系數(shù)的不同進行提取和分離[7]。液液萃取前處理方法操作簡單,但實驗消耗試劑較大,無論是對實驗員還是環(huán)境都造成一定的危害,且實驗重現(xiàn)性差,回收率低[8]。對于基質(zhì)復(fù)雜的動物源食品前處理來說,液液萃取很少單獨使用,一般需配合其他前處理方法共同應(yīng)用。劉培勇等[9]采用兩步液液萃取對豬肉樣品進行提取,即用乙酸乙酯和丙酮分別萃取,采用Oasis MCX 混合陽離子固相萃取小柱對提取液進行凈化富集,結(jié)合HPLC-MS對樣品進行檢測。結(jié)果顯示,在20~400 μg/L線性范圍內(nèi)11種磺胺類藥物相關(guān)系數(shù)均大于0.99,呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。
免疫親和色譜(Immunoaffinity Chromatography,IAC)是指利用抗體或者與抗體相關(guān)的材料作為固定相的色譜,與抗原性物質(zhì)特異性結(jié)合的技術(shù),其他樣品基質(zhì)及雜質(zhì)由于不與固定相結(jié)合而被除去。Haas等[10]用瓊脂糖包埋克倫特羅多克隆抗體的免疫親和預(yù)柱進行自動樣品預(yù)處理和測定小牛尿液中的克侖特羅。與其他前處理方法相比較,免疫親和色譜的特異性更強。但由于實驗中需要大量純化特異性抗體作為固定相,成本消耗較高,限制了免疫親合色譜法在多獸殘檢測中的應(yīng)用。
固相萃取技術(shù)(Solid phase extraction,SPE)是通過固體吸附劑對目標(biāo)組分進行選擇性吸附,從而達到分離、純化和濃縮目標(biāo)物的目的[11]。固相萃取技術(shù)從開發(fā)至今,因其簡單、高效、快速而被廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域。相對比傳統(tǒng)的液液萃取,SPE更快,更節(jié)省溶劑,重現(xiàn)性較好,現(xiàn)已成為前處理的首選方法。此外,固相萃取還可以與其他分析方法和樣品前處理技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于樣品中,針對不同基質(zhì)形成專屬性方法。Koesukwiwat等[12]建立了固相萃取結(jié)合HPLC-MS技術(shù)對牛奶中6種磺胺類、3種四環(huán)素和乙胺嘧啶進行同時檢測的方法。結(jié)果表明,此方法穩(wěn)定、可靠,適用于牛奶的常規(guī)分析和多殘留確認。Piatkowska等[13]建立固相萃取結(jié)合HPLC-MS對雞蛋中的獸藥多殘留進行同時測定的方法,方法使用含有EDTA 0.1%甲酸的乙腈-水(8∶2)溶液對雞蛋樣品進行提取,使用HybridSPE柱通過固相萃取對提取液進行凈化,經(jīng)驗證該方法適用于雞蛋中獸藥、飼料添加劑和非法染料的多殘留分析。固相萃取法對待測物有較好的富集作用,能降低基質(zhì)干擾。但對于基質(zhì)復(fù)雜的動物源性食品樣品來說,常規(guī)固相萃取難以兼容不同類別的多獸藥殘留的同時提取凈化。
QuEChERS是近年來國際上最新開發(fā)的用于檢測的快速樣品制備技術(shù)。它是由美國化學(xué)家史蒂芬教授和德國科學(xué)家Michela于2003年開發(fā)的[14-16]。最初是作為農(nóng)殘品快檢的前處理方法[15,17],主要由提取、凈化、濃縮三部分組成。QuEChERS之所以可以被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域,主要是因為其可針對化合物、基質(zhì)性質(zhì)不同而進行提取溶劑、凈化材料的種類以及比例的優(yōu)化,相對于其他樣品前處理方法,QuEChERS方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好且易于操作,符合復(fù)雜基質(zhì)微量有機物檢測的要求,近年來被逐步應(yīng)用于動物源性食品樣品中獸藥殘留的分析[18]。王偉等[19]采用QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS對蜂蜜中60種獸殘進行同時測定,樣品經(jīng)Mcllvaine緩沖溶液稀釋,5%乙酸乙腈提取,NH2吸附劑凈化,LC-MS/MS進行檢測,該方法具有一次處理進樣即可對蜂蜜中殘留的60種獸藥殘留同時測定的特點。
動物源性食品獸藥殘留含量相對較低、干擾物多,屬于復(fù)雜基質(zhì)樣品中微量組分的檢測技術(shù)。當(dāng)前,動物源性食品的獸藥殘留檢測以色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主,常用的聯(lián)用技術(shù)有氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)主要應(yīng)用于食品中熱穩(wěn)定、易揮發(fā)小分子的痕量化合物檢測。對于動物源性食品多獸藥殘留檢測,GC-MS使用受限,需與LC-MS結(jié)合使用。Lozano等[20]對蜂箱樣品進行了LC-MS/MS和GC-MS/MS分析,共檢測到322種化學(xué)殘留物,分析范圍較廣。
近些年隨著液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的發(fā)展,該技術(shù)現(xiàn)已成為分析痕量有機物的常用方法,可用來測定μg/kg痕量有機物,在動物源性食品中獸藥殘留的定性、定量具有廣泛應(yīng)用[21]。Zhang等[22]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLCMS/MS)法,用于同時分析雞肉中的8種抗病毒藥物(阿比多爾、金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋、帕拉米韋、咪喹莫特、奧司他韋和拉米夫定)的殘留。結(jié)果顯示,8種抗病毒藥物的平均回收率在70%~120%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(SRSD)小于10%。Hoyos等[23]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法建立了一種高靈敏度的檢測牛脂肪、腎臟、肝臟和肌肉組織中標(biāo)記殘留物22, 23-二氫阿維菌素B1的定量/確證方法,方法回收率在70%~120%范圍內(nèi),實驗室內(nèi)重復(fù)性小于20%,檢出限為0.05~0.12 μg/kg。
液相色譜-離子阱質(zhì)譜(Liquid chromatography coupled to ion trap mass spectrometry,LC-IT-MS)在化合物檢索能力上彌補了LC-MS/MS寬泛性不足的缺點,可以同時對多種痕量化合物進行確證以及篩選。Casado等[24]用超高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜檢測器(UHPLC-IT-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對肉中23種獸藥殘留(β受體阻滯劑、β受體激動劑和非甾體抗炎藥)進行同時測定,方法檢出限為0.01~18.75 μg/kg,方法定量限為0.02~62.50 μg/kg。并對實際牛肉樣品進行檢測,在某些樣品中檢測到了普萘洛爾、酮洛芬和雙氯芬酸的痕跡。Kang等[25]建立了用離子阱LC-IT-TOF/MS篩選百余種獸藥殘留的多殘留方法,結(jié)果證明這種篩選方法可以在一次分析中對肉、奶、蛋和魚中的100多種獸藥進行同時分析。
液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(Liquid chromatographytime-of-flight mass spectrometry,LC-TOF-MS)為高分辨質(zhì)譜,對相近質(zhì)核比的化合物具有較好的分辨能力,有利于相近離子的區(qū)別和定性。Dasenaki等[26]使用超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLCQTOF-MS)開發(fā)了一種寬范圍的篩選方法,用于鑒定魚組織和牛奶中的獸藥殘留。Villar-Pulido等[27]建立以乙腈為提取溶劑,伯仲氨為凈化材料的QuEChERS前處理方法結(jié)合LC-TOF-MS對蝦中抗生素和其他獸藥進行快速檢測和定量的方法,并對從超市采集的12批蝦進行實際樣品的檢測,證實該方法的適用性。
毛細管電泳-質(zhì)譜(Capillary electrophoresis-mass,CE-MS)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展克服了CE靈敏度低的缺點。CE具有分離效率高、速度快、低消耗以及易于操作的特點。在動物源食品獸殘檢測中主要適用于弱強離子代謝物以及它們立體結(jié)構(gòu)的檢測[28]。Blasco等[29]基于CE-MS/MS對牛奶中8種殘留的獸藥(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺乙酰胺、磺胺苯甲酰胺、磺胺氯噠嗪、磺胺喹喔啉、磺胺噻唑和磺胺異惡唑)同時測定。采用乙腈作為提取溶劑,Oasis HLB固相萃取柱對提取液進行凈化,8種獸藥的回收率均大于78%,實現(xiàn)首次使用CE-ESI-MS/MS對牛奶中的獸藥進行分析。
隨著現(xiàn)代技術(shù)儀器的不斷發(fā)展,一些新型的聯(lián)用技術(shù)現(xiàn)也可應(yīng)用于動物源性食品中獸藥殘留的檢測,如離子淌度質(zhì)譜是檢測痕量分析物的一種非常有前途的聯(lián)用技術(shù)[30]。
近些年,獸藥的不合理使用已成為威脅動物源性食品安全的一個非常重要的問題。如何建立靈敏、快速的分析技術(shù)來分析動物源性食品中的獸藥殘留問題已成為一項挑戰(zhàn)。一是如何建立快速高效的樣品前處理技術(shù)提高效率節(jié)約成本;二是如何建立多種獸藥殘留的定性定量方法。因此,尋找一種簡單、高度靈敏和快速的定性檢測多種獸藥殘留的方法是動物源性食品檢測的重中之重。