Brillouin顯微鏡測(cè)量角膜生物力學(xué)性能的研究進(jìn)展

嚴(yán)夢(mèng)迪 高蓉蓉 王俊杰 王勤美 黃錦海

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 325027

角膜是眼球光學(xué)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，其屈光力占眼球光學(xué)系統(tǒng)總屈光力的2/3以上。探索角膜的生物力學(xué)性質(zhì)在角膜形狀與透明度的維持、圓錐角膜的診治、屈光手術(shù)的設(shè)計(jì)以及人工角膜的研發(fā)等方面有重要參考意義[1]。目前，角膜生物力學(xué)研究的離體實(shí)驗(yàn)包括單軸拉伸實(shí)驗(yàn)[2-4]、全眼球膨脹實(shí)驗(yàn)[5]等，在體測(cè)量的儀器較少，主要有眼反應(yīng)分析儀（Ocular response analyzer，ORA）和可視化角膜生物力學(xué)分析儀（Corneal visualization Scheimpflug technology，Corvis ST）。Brillouin顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)在體角膜生物力學(xué)特性的無接觸測(cè)量，提供微觀的三維分布，有望成為臨床角膜生物力學(xué)測(cè)量的新技術(shù)[6]。本綜述將闡述Brillouin顯微鏡的測(cè)量原理、安全性以及與其他設(shè)備的比較，并總結(jié)其臨床應(yīng)用進(jìn)展。

1 Brillouin顯微鏡的測(cè)量原理和結(jié)構(gòu)

Brillouin光譜長(zhǎng)期應(yīng)用于材料表征和環(huán)境傳感[7]，并在20世紀(jì)80年代早期開始用于生物組織[8]。分子的熱波動(dòng)產(chǎn)生以聲速傳播的壓力波動(dòng)，即聲波。聲速與組織的縱向模量（M'）成比例。Brillouin光散射是由光和組織中的內(nèi)在聲波相互作用產(chǎn)生的。光從組織反射時(shí)產(chǎn)生的多普勒頻移與焦點(diǎn)處組織的聲速成比例，可間接反映該處組織的縱向模量。Brillouin頻移與組織的縱向模量之間存在著如下關(guān)系[9]：其中νB是Brillouin頻移，n是組織的折射率，λ是入射光的波長(zhǎng)，M'是縱向模量，ρ是組織的密度，θ是入射光與散射光的夾角。角膜組織的折射率和密度之間遵循Gladstone-Dale關(guān)系[10]，ρ/n2的比率在角膜中的變化很小[11]，故通過測(cè)得的頻移可計(jì)算出角膜組織的縱向模量?？v向模量是指復(fù)合材料在沿正軸縱向單軸拉伸或壓縮載荷作用下，在線性變化的范圍內(nèi)產(chǎn)生單位長(zhǎng)度的線應(yīng)變所需要的應(yīng)力大小。楊氏模量（E'）也是用于表示組織抵抗形變能力的物理量，代表各向同性的彈性組織的剛度，定義為在遵循胡克定律的情況下，單軸應(yīng)力和單軸應(yīng)變之間的比值。經(jīng)驗(yàn)證明，Brillouin測(cè)量的縱向模量和楊氏模量是對(duì)數(shù)線性關(guān)系：log（M'）=alog（E'）+b，其中a和b是組織依賴性系數(shù)，如豬眼的a=0.093、b=9.29，牛眼的a=0.034、b=9.50[12]。

Brillouin顯微鏡由激光掃描共聚焦顯微鏡和雙重虛擬成像陣列（Virtually imaginary phased array，VIPA）光譜儀組成[13]，將低功率窄帶近紅外激光束聚焦到角膜組織中，通過高分辨共聚焦光譜儀分析來自焦點(diǎn)處的Brillouin頻移[14]，求得縱向模量。激光束在不同部位的掃描，可反映出組織每個(gè)部位的縱向模量[6]。

2 Brillouin顯微鏡的安全性

眼部最大允許暴露量（Maximum permissible exposure，MPE）定義為激光在不引起生物危害的情況下進(jìn)入人眼的最高功率或能量密度，相當(dāng)于有50%概率會(huì)造成傷害的劑量的十分之一[15]。根據(jù)國(guó)際非電離輻射防護(hù)委員會(huì)（International Commission on Non-ionizing Radiation Protection，ICNIRP）的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于波長(zhǎng)范圍為400～1 050 nm的連續(xù)波光源，照射時(shí)間在10 s以內(nèi)，角膜的暴露極限為4 W/cm2，即直徑為1 mm的圓形區(qū)域（面積為0.79 mm2）的MPE為32 mW。對(duì)于直徑為7 mm的圓形區(qū)域視網(wǎng)膜，照射1 s和60 s的MPE分別為265 mW和95 mW[16]。Brillouin顯微鏡使用的是低功率激光，并且采集時(shí)間相對(duì)較短，不會(huì)對(duì)人眼造成危害。目前各個(gè)研究所采用的激光功率和采集時(shí)間具有較大差異，但均處于以上安全范圍之內(nèi)，例如Scarcelli和Yun[17]使用0.7 mW的780 nm激光，采集時(shí)間為0.4 s；Webb等[18]使用10 mW的532 nm激光，采集時(shí)間為0.2 s；Seiler等[19]使用5 mW的780 nm激光，采集時(shí)間為0.7 s。

3 Brillouin顯微鏡與其他設(shè)備的比較

臨床現(xiàn)有的角膜生物力學(xué)特性的在體測(cè)量設(shè)備包括ORA和Corvis ST，二者都基于測(cè)量角膜對(duì)空氣脈沖的動(dòng)態(tài)形變反應(yīng)。ORA是第一個(gè)應(yīng)用于臨床，評(píng)估活體角膜生物力學(xué)性能的儀器，利用空氣脈沖使角膜壓陷，產(chǎn)生1個(gè)雙向壓平的動(dòng)態(tài)過程，電子光學(xué)分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)角膜形變的過程，記錄2個(gè)壓平壓力測(cè)量值，通過計(jì)算得到角膜滯后量（Corneal hysteresis，CH）及角膜阻力因子，可診斷圓錐角膜等角膜疾病[20-22]。但由于CH受角膜厚度、硬度、眼內(nèi)壓以及角膜水合作用的影響，并不能真實(shí)反映角膜生物力學(xué)特性。Corvis ST利用Scheimpflug高速攝像實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)記錄中央8 mm直徑范圍的角膜受壓后橫截面的完整形變過程，同時(shí)可分析記錄最大變形幅度、最高凹陷時(shí)間、峰峰距離、中央角膜厚度、DAratio、SPA1和角膜生物力學(xué)指數(shù)（Corneal biomechanical index，CBI）等，其中CBI已被證明可提高圓錐角膜檢測(cè)敏感度[23]。ORA基于動(dòng)態(tài)雙向壓平的原理，Corvis ST采用氣沖印壓技術(shù)，二者在測(cè)量過程中都需要產(chǎn)生1個(gè)空氣脈沖使角膜凹陷，通過形變過程中的各個(gè)參數(shù)來間接分析角膜生物力學(xué)特性，對(duì)患者造成不適感。此外，ORA和Corvis ST均將角膜視為一個(gè)各向同性的組織，該均一化假設(shè)違背了角膜各向異性的特點(diǎn)，不能反映角膜各部分的生物力學(xué)差異，故診斷敏感性有待進(jìn)一步提高。二者用于角膜交聯(lián)術(shù)后角膜硬度改變的評(píng)估，不同研究之間結(jié)果存在差異。此外，目前二者提供的角膜形變參數(shù)尚無法求出角膜本構(gòu)參量。Brillouin顯微鏡在測(cè)量過程中無需對(duì)角膜施加外力，具有更高的測(cè)量舒適性，可以直接讀出組織的局部特征，提供微觀的角膜生物力學(xué)特性三維分布圖[24]。Brillouin顯微鏡提供的縱向模量可以直接代表材料的本構(gòu)屬性。

4 Brillouin顯微鏡在角膜疾病方面的應(yīng)用

4.1 正常角膜的基線數(shù)據(jù)

目前Brillouin顯微鏡的主要波長(zhǎng)為780 nm。關(guān)于正常人角膜的Brillouin頻移參考值范圍尚無統(tǒng)一觀點(diǎn)，Yun和Chernyak[6]測(cè)得780 nm波長(zhǎng)下正常人角膜的頻移在5.69～5.76 GHz之間的狹窄范圍內(nèi)；Scarcelli和Yun[17]觀察到頻移在角膜前部的100～400 μm處從5.6 GHz緩慢下降至5.5 GHz，而在角膜后部200 μm處從5.5 GHz急劇下降至5.2 GHz，Brillouin頻移的這一急劇下降可能在生物力學(xué)上反映了角膜結(jié)構(gòu)的改變。其他研究者也報(bào)道了相似的結(jié)果[8，25]。Scarcelli等[24]研究中的測(cè)量值與上述值存在差異，其測(cè)得角膜上皮的頻移為6.5～6.6 GHz，角膜基質(zhì)為6.5 GHz。

由于聲速隨組織中的水含量而變化[26]，Brillouin測(cè)量對(duì)角膜水合作用較敏感，或許是上述角膜頻移有偏差的原因。近期有研究顯示，志愿者醒來后1 h角膜厚度逐漸減小，而Brillouin頻移增加[27]。Seiler等[19]使用不同濃度的右旋糖酐對(duì)兔角膜脫水后進(jìn)行Brillouin測(cè)量和角膜條帶拉伸試驗(yàn)后顯示，高濃度（20%）的右旋糖酐處理后的角膜縱向模量和彈性模量分別是低濃度（5%）處理后的1.2倍和4.4倍，且隨著角膜脫水程度的變化，縱向模量與角膜厚度呈負(fù)相關(guān)，并首次證明了縱向模量不隨應(yīng)力的變化而改變，即Brillouin測(cè)量無法描述角膜組織的非線性特征。有研究通過對(duì)離體牛角膜進(jìn)行水化處理令角膜明顯膨脹，26 h后角膜厚度幾乎加倍[28]，此時(shí)水合作用明顯超過正常水平[29]，且測(cè)得角膜所有深度的Brillouin頻移減小，表明腫脹的角膜變得更柔軟。0.5 h時(shí)，角膜前部的頻移為6.3～6.5 GHz，后部為6.2～6.5 GHz，26 h后減小為6.0～6.3 GHz[28]。此外，腫脹的角膜中測(cè)量的頻移變化表明組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)完整性喪失，符合角膜過度水合和水腫的常見變化[30，31]。Brillouin測(cè)量對(duì)水合作用的敏感性可能與膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)的可壓縮性有關(guān)，也可能反映了組織的結(jié)構(gòu)和分子變化。

人眼角膜緣的Brillouin頻移值低于中央角膜，特別是在角膜的最前部區(qū)域[28，32]，上皮下存在10～15 μm厚的Brillouin頻移最高的組織，推測(cè)為前彈力層[32]。目前采用Brillouin顯微鏡對(duì)角膜組織進(jìn)行的研究較少，其角膜各部分的正常參考值范圍有待進(jìn)一步大樣本量、多中心的研究。

4.2 角膜疾病的診療和篩查

4.2.1 Brillouin顯微鏡與圓錐角膜的診斷 圓錐角膜是一種退行性眼病，其特征在于生物力學(xué)減弱的角膜局部在眼內(nèi)壓的作用下進(jìn)行性變薄和前凸。目前對(duì)該疾病的診斷多依賴于角膜地形圖和Corvis ST，但早期的診斷和鑒別較困難。開發(fā)一種測(cè)量角膜力學(xué)性能的儀器十分有必要，有助于圓錐角膜發(fā)展機(jī)制的探索，圓錐角膜的早期診斷和早期干預(yù)，還有助于LASIK術(shù)后角膜膨隆的篩查。較多研究比較了圓錐角膜和正常角膜的Brillouin測(cè)量值，認(rèn)為二者之間存在明顯差異。Scarcelli等[33]對(duì)比了8個(gè)健康角膜供體和10個(gè)晚期圓錐角膜，在取下角膜后2 h內(nèi)，使用波長(zhǎng)為532 nm的Brillouin顯微鏡測(cè)量，得到圓錐角膜前200 μm的平均頻移為（7.99±0.10）GHz，明顯低于健康角膜的（8.17±0.06）GHz，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。此外，該研究中，在圓錐角膜內(nèi)，遠(yuǎn)離錐頂區(qū)的頻移顯著高于錐形區(qū)。最近，Seiler等[34]比較了47例健康眼與36例圓錐角膜眼，同樣證明了圓錐角膜錐體中央?yún)^(qū)的頻移均低于健康眼。Shao等[35]比較了正常角膜與不同階段圓錐角膜患者的Brillouin測(cè)量結(jié)果，顯示正常角膜測(cè)量值在中央與周邊無明顯差異，且左右眼具有較高的對(duì)稱性，隨著圓錐角膜的進(jìn)展，其生物力學(xué)的不均勻性以及左右眼間的不對(duì)稱性均增加。此外，I、II期的圓錐角膜與正常角膜差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，I期錐體內(nèi)兩眼的差異約24 MHz，但晚期患者Brillouin頻移測(cè)量值明顯降低，為100～200 MHz。

4.2.2 Brillouin顯微鏡與角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Corneal collagen cross-linking，CXL）的療效 CXL出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代，在2003年開始用于治療進(jìn)展期圓錐角膜，能顯著增強(qiáng)角膜的生物力學(xué)性能。同時(shí)，CXL也能治療角膜炎[36]、角膜溶解[37]、角膜基質(zhì)水腫[38]等病變。Randleman等[9]評(píng)估了11只豬眼的基線狀態(tài)、制作LASIK皮瓣造模后以及快速CXL術(shù)后的角膜不同深度的Brillouin頻移，結(jié)果顯示，制作皮瓣后，前部和中部區(qū)域角膜的頻移較基線顯著下降，而后部的降幅較少；再行快速CXL術(shù)后的頻移比制作皮瓣后略微增高，但術(shù)后角膜任何深度的頻移增高與制作皮瓣后的頻移相比差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Scarcelli等[39]對(duì)新鮮豬眼進(jìn)行CXL后，其縱向模量明顯增加，且前基質(zhì)層的增加幅度大于后基質(zhì)層。Webb等[18]采用不同強(qiáng)度但總能量相同的紫外線進(jìn)行豬眼CXL，觀察到術(shù)后縱向模量和彈性模量較未處理組均有增加，且2種模量的增加具有一致性，增幅隨照射強(qiáng)度的增大而減小，CXL的效果局限于角膜前中部。以上研究反映出Brillouin顯微鏡可以評(píng)估CXL后角膜組織不同深度的生物力學(xué)變化，但該變化與交聯(lián)方案之間的具體關(guān)系有待進(jìn)一步探索。

5 展望

Brillouin顯微鏡為角膜生物力學(xué)特性（縱向模量）的測(cè)量提供了一種安全、非接觸和三維的方法，其發(fā)展有望將生物力學(xué)本構(gòu)參量測(cè)量引入臨床，在許多角膜疾病的診斷和治療上具有廣闊的前景。目前對(duì)Brillouin顯微鏡測(cè)量角膜縱向模量的算法和模型有待進(jìn)一步優(yōu)化。此外，目前Brillouin顯微鏡在眼科其他疾病中的應(yīng)用較少，未來還可以通過更多的研究來擴(kuò)展其應(yīng)用價(jià)值。然而，要將Brillouin顯微鏡廣泛應(yīng)用于臨床上，仍需要進(jìn)一步大量的研究數(shù)據(jù)。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明嚴(yán)夢(mèng)迪：收集文獻(xiàn)資料并歸納分析，撰寫論文，根據(jù)修改意見進(jìn)行論文修改。黃錦海、高蓉蓉：參與選題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)資料的分析和解釋，參與論文的修改。王俊杰、王勤美：對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱