金諾芬在卵巢癌中的作用機制及研究進展

劉小平，王銘遠，2，肖彩艷，王勁進*（.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院婦產科，湖南 株洲 42000，2.中南大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，長沙 40008）

卵巢癌是常見的婦科腫瘤，全球統(tǒng)計數據表明，每年約有30萬例新診斷的卵巢癌病例，其中60%以上因該病死亡[1]。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性腫瘤標記物等，超過70%的卵巢癌患者確診時即為晚期；經正規(guī)治療達到臨床完全緩解后，約70% 的人在兩年內出現腫瘤復發(fā)[2]。目前治療方案以手術為主，鉑類為基礎的聯合化療為輔，但鉑類藥物毒副作用大且易產生耐藥，成為卵巢癌治療失敗的主要原因[3]。因此，尋找和開發(fā)新型藥物聯合應用以降低鉑類藥物毒性和耐藥性、增加抗腫瘤療效是卵巢癌治療的迫切需求。

金屬配合物（如鉑、金和銅）已顯示出巨大的抗腫瘤潛力[4]，其中，金諾芬（auranofin，AF）是第一個被發(fā)現有抗腫瘤活性的一價含金化合物，有治療潛力但目前缺乏系統(tǒng)研究。已有研究表明AF有廣泛的生物學活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤[5-9]等。AF可通過阻滯細胞周期、誘導凋亡、誘導氧化應激等發(fā)揮抗腫瘤作用，由于其存在多種氧化態(tài)及多種結構的配體，抗腫瘤作用機制較復雜，具體作用機制尚未完全闡述清楚[10]。本文就AF在卵巢癌中的研究現狀進行綜述，為AF的進一步研究和臨床應用提供參考。

1 AF抑制卵巢癌細胞的生長增殖

正常細胞遵循G0/G1-S-G2-M的周期順序，細胞周期紊亂是癌變的重要起因及基本特征。AF能將腫瘤細胞阻滯在細胞周期的不同階段，從而抑制腫瘤無限增殖。在Calu-6細胞和SK-LU-1細胞中，低濃度的AF即可將其分別阻滯在G2/M期和G1期，從而抑制腫瘤細胞增殖[11]。Gandin等[12]發(fā)現不同AF衍生物處理卵巢癌細胞后Sub-G1期細胞（常代表凋亡細胞數目）較對照組增加6～14倍，進而影響DNA合成，抑制卵巢癌細胞的增殖。Park等[13]指出AF治療組腫瘤細胞的存活數約為對照組的1/13，且AF呈劑量和時間依賴性地抑制卵巢癌細胞的存活和增殖[13-14]。Wang等[14]首次證明AF可能通過抑制癌基因——蛋白激酶C1（PKC1）信號轉導，影響具有自我更新能力的腫瘤起始細胞（TICs）從而抑制卵巢癌細胞增殖。在動物模型中，AF也發(fā)揮強大的抗腫瘤活性[14-16]。研究發(fā)現AF治療組小鼠腫瘤細胞的有絲分裂指數較對照組降低，小鼠瘤體積也明顯減小。27 d后對照組小鼠因出現臨床癥狀而終止實驗，AF治療組則沒有出現任何臨床癥狀[14]。

此外，研究表明AF能不可逆地抑制卵巢癌順鉑敏感細胞系（2008、A2780-S）和順鉑耐藥細胞系（C13、A2780-R）的增殖和集落的形成能力[16-17]。AF對卵巢癌順鉑耐藥細胞同樣能發(fā)揮抗腫瘤效應。在OVCAR8細胞中，AF的IC50值約為0.34 μmol·L－1，而順鉑的IC50值約為8.95 μmol·L－1，這表明更小劑量的AF即可發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。

2 AF誘導卵巢癌細胞凋亡

細胞凋亡（即Ⅰ型程序性細胞死亡）是嚴格受基因調控以維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程。細胞凋亡途徑包括死亡受體介導的外源性途徑和線粒體介導的內源性途徑，AF可通過調節(jié)凋亡相關蛋白、線粒體等多個環(huán)節(jié)誘導凋亡。

2.1 AF影響B(tài)細胞淋巴瘤-2（BCL-2）蛋白家族誘導凋亡

BCL-2家族是一類調控細胞凋亡的關鍵因子，其中BCL-2和BAX分別是BCL-2家族中最主要的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白。AF可通過上調促凋亡蛋白BAX和BIM，下調抑凋亡蛋白BCL-2和IκB激酶（IKK-β）的表達誘導卵巢癌細胞凋亡[13]。

2.2 AF影響半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族誘導凋亡

Caspase家族能選擇性切割某些蛋白從而誘導凋亡，其中Caspase-3起著核心誘導作用[19]。Marzo等[15]研究發(fā)現AF處理A2780細胞后，Caspase-3表達量幾乎是對照組的10倍，凋亡顯著增加；在小鼠模型中，AF顯著減少瘤體積的同時不影響治療組小鼠的行為、活力及體重。Gandin等[12]的研究結果也表明，AF通過誘導Caspase-3激活從而介導細胞凋亡，其中AF處理組細胞凋亡特征較對照組更為顯著，主要表現為細胞染色質濃縮和核DNA片段化明顯增加。與此同時，Park等[13]發(fā)現AF可能通過調控IKK-β/叉頭框蛋白O3（FOXO3）途徑誘導SKOV3細胞凋亡。轉錄因子FOXO3有促進凋亡、抗氧化、延長壽命等多種生物學功能。在卵巢癌細胞中，沉默FOXO3可顯著減少Caspase-3介導的凋亡，AF可通過下調IKK-β使FOXO3轉錄活性增加，從而誘導卵巢癌細胞凋亡。

2.3 AF影響線粒體細胞色素C（Cyt-c）誘導凋亡

Cyt-c從線粒體釋放到胞漿和線粒體膜電位喪失是線粒體凋亡途徑的關鍵步驟[20]，研究表明AF可引起Cyt-c的釋放和線粒體膜電位的改變[21]。在順鉑敏感和耐藥的卵巢癌細胞中，AF與曲美替尼聯用均能誘導Cyt-c釋放，增加凋亡標志物DNA片段化，從而顯著誘導細胞凋亡[22]。在肝癌[23]和肺癌[11]細胞中AF通過誘導線粒體膜電位損失，引起線粒體功能障礙從而誘導其凋亡。但Hyter等[24]發(fā)現在卵巢癌細胞中，經AF治療后的線粒體膜電位沒有發(fā)生明顯變化。故AF能否通過改變卵巢癌細胞線粒體膜電位從而誘導凋亡仍有待進一步研究證實。

3 AF誘導卵巢癌細胞氧化應激

細胞內各種生理生化反應的順利進行，都需要一個氧化還原平衡的穩(wěn)定內環(huán)境，當生物遭受到環(huán)境壓力時一般會伴隨活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量產生。AF可通過誘導腫瘤細胞氧化應激發(fā)揮抗卵巢癌作用。硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)（體內重要的抗氧化系統(tǒng)）的關鍵酶，Trx系統(tǒng)維持機體內氧化還原穩(wěn)態(tài)的前提是Trx處于還原狀態(tài)，而TrxR是細胞內部唯一已知的可以將Trx還原的物質[25]。AF是TrxR的特異性抑制劑，通過靶向抑制TrxR氧化還原活性中心[26]，使得氧化應激產物ROS在體內過度蓄積從而引起細胞氧化損傷[27]。研究發(fā)現，TrxR在許多腫瘤中過表達[23，28]，高表達的TrxR會促進腫瘤發(fā)展[29]，這可能與其抗凋亡、促進新生血管生成和轉移有關[30]。在卵巢癌細胞中，AF同樣通過抑制TrxR的表達，誘導ROS產生，發(fā)揮抗腫瘤作用。Oommen等[31]還發(fā)現AF可劑量依賴性地增加DNA雙鏈斷裂（DNA DSB），減少細胞克隆，誘導DNA損傷和細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。而應用抗氧化劑N-乙?；腚装彼幔∟AC）可顯著減少AF誘導的卵巢癌細胞DNA損傷和凋亡。由此推測AF可能通過抑制TrxR導致ROS蓄積，影響細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。

研究還發(fā)現化療耐藥的卵巢癌細胞中往往顯示出更高的TrxR水平[17]，并且納摩爾級別的AF即可抑制TrxR活性[16]。Yamada等[32]證實順鉑耐藥的卵巢癌細胞系中耐藥程度與TrxR表達水平成正相關，并且AF比順鉑能更有效地降低細胞活力[16-17]，故AF可有效逆轉卵巢癌細胞順鉑耐藥。在紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞A2780/PTX中發(fā)現Trx1和FOXO1較敏感細胞過表達，而沉默Trx1后FOXO1活性降低，細胞對紫杉醇的敏感性增加[33]，AF逆轉卵巢癌細胞紫杉醇耐藥的機制之一可能是通過抑制Trx1/FOXO1信號通路實現的。此外，Landini等[34]研究表明，TrxR的高表達是細胞產生AF耐藥性的原因之一，而對AF耐藥的A2780/AF-R細胞對順鉑不耐藥。

綜上，AF在順鉑和紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞中均可能通過抑制TrxR，誘導氧化應激而表現出良好的抗腫瘤活性，同時A2780/AF-R細胞對順鉑敏感，這表明AF與順鉑不存在交叉耐藥。故AF有望與化療藥物聯合應用于卵巢癌的治療。

4 AF與其他藥物聯用抑制卵巢癌

許多研究表明AF與其他藥物聯用時可更有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。Kato等[35]發(fā)現AF與無毒劑量的MI-463（Menin混合譜系白血病抑制劑）聯用后顯著增加血紅素加氧酶-1（HO-1）的mRNA和蛋白表達，從而誘導卵巢癌細胞鐵死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。Bae等[36]發(fā)現單用AF或沉默黏蛋白4（MUC4）不影響SKOV3細胞中凋亡相關蛋白的表達，但協同使用后BAX和BIM上調，BCL-2下調，PARP1和Caspase-3裂解增加，抗卵巢癌作用顯著增加。Papaioannou等[37]發(fā)現AF在卵巢癌細胞中抑制Trx系統(tǒng)后可顯著增強雙硫侖（一種活性氧誘導藥物）的細胞毒作用。此外，AF與曲美替尼的組合可能通過誘導ROS促進腫瘤細胞中p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，從而誘導線粒體應激，隨后通過釋放凋亡誘導因子來促進腫瘤細胞凋亡[22]。因此聯合用藥可能更進一步增強AF的抗卵巢癌作用。

5 展望與結語

AF于1985年經FDA批準用于類風濕關節(jié)炎的臨床治療[38]，但尚未作為抗腫瘤藥物進入臨床。“老藥新用”不僅可以節(jié)省時間和成本，還可為藥物作用機制和疾病生物學提供新思路。金屬配合物的中心金屬離子具有多種配位數和幾何構型，這些構型賦予其廣泛的生物活性，而金屬離子獨特的性質又賦予了配合物特有的理化性質[39]；此外，配合物中的配體還能以協同作用方式發(fā)揮重要的藥理作用。AF的配體——三乙基膦基（R3P）增加了AF的穩(wěn)定性及脂溶性，有助于其滲透進入細胞膜，而去除R3P后AF的細胞毒性降低了150倍[40]。順鉑主要以DNA為作用靶點[41]，而腫瘤細胞對DNA損傷具有修復能力，因此容易出現耐藥性。與順鉑不同，AF的主要作用靶點包括線粒體和蛋白酶體，這可能與其特異性抑制含硒蛋白TrxR有關[42-43]。主要作用靶點不同可能是AF與順鉑無交叉耐藥的原因之一。AF的給藥途徑為口服，與靜脈給藥的鉑類藥物相比，藥物不良反應相對較少，患者依從性高。順鉑及其代謝產物主要經腎臟排泄，故腎毒性明顯，而AF主要經糞便排泄，主要表現為胃腸道不良反應，且不良反應較少。

大量研究表明，AF能有效逆轉卵巢癌細胞順鉑耐藥[15-17]，這可能還與腫瘤細胞的膜流動性相關。腫瘤細胞的膜流動性通常大于正常細胞，并且膜流動性與腫瘤細胞惡性程度及化療耐藥成正相關[44]。順鉑處理的卵巢癌細胞膜流動性迅速增加[45]，但AF對卵巢癌細胞膜流動性沒有明顯影響[46]。因此與順鉑相比，AF可能不易產生化療耐藥。進一步研究發(fā)現卵巢癌細胞系中膜流動性與AF敏感性之間存在正相關，即惡性程度高的腫瘤可能對AF更為敏感[46]。因此，AF對于惡性程度高和順鉑耐藥的卵巢癌具有重要意義。

目前，AF因其重要的抗腫瘤作用已被納入多種疾病的臨床試驗階段，如卵巢癌（NCT01747798）、肺癌（NCT01737502）和白血?。∟CT01419691）。在卵巢癌的臨床試驗中，納入10名CA-125升高的無癥狀卵巢癌術后患者，進行為期28 d的口服AF治療。結果發(fā)現4名患者在AF治療后的第一個月內CA-125趨于穩(wěn)定（即升高或降低程度低于50%），1名患者在經AF治療后的3個月內CA-125逐步降低，而停用AF后CA-125顯著增加。在這項試驗中，大多數患者對AF的耐受性良好[47]。這些臨床研究均表明有必要進行更多的臨床前和臨床研究，以證實AF的潛在抗腫瘤活性及治療劑量和安全性。

綜上，卵巢癌因其惡性程度高、復發(fā)率高已成為婦科腫瘤的治療難題，鉑類化療藥物的腎毒性、骨髓抑制及消化道等不良反應嚴重限制其在臨床的應用，且許多患者在初始化療后產生鉑耐藥。故尋找新型抗腫瘤藥物以克服鉑類藥物的不足之處顯得尤為重要。AF以其重要的抗腫瘤作用及逆轉順鉑耐藥為卵巢癌患者的臨床治療帶來希望。目前AF在卵巢癌中的作用機制研究主要集中在抑制細胞增殖、誘導凋亡和抑制TrxR等方面，是否存在其他相關機制仍有待進一步研究。AF具有一般金屬配合物的共同特性，同時與順鉑無交叉耐藥，且不良反應較少。但其用于治療卵巢癌的臨床使用劑量及安全性仍需更多臨床試驗證實。隨著人們對AF抗腫瘤作用機制及研究進展的不斷深入，其有望成為有效的抗腫瘤藥物，為臨床治療帶來希望。