華蟾素片對CT26結(jié)腸腺癌誘導(dǎo)惡病質(zhì)小鼠肌肉萎縮的影響

林毅，王振飛，肖靜

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院肛腸三科，福建福州350004

進(jìn)行性骨骼肌流失與消耗是癌性惡病質(zhì)(cancer cachexia，CC)最典型、最復(fù)雜的特征[1]。它常常導(dǎo)致患者的體重下降、活動(dòng)能力減退等，最終導(dǎo)致免疫功能低下，治療耐受力下降，縮短了總生存時(shí)間[2]。研究表明，腫瘤誘導(dǎo)的肌蛋白降解密切相關(guān)的是泛素蛋白連接酶E3，而其中最重要的標(biāo)記物是肌萎縮F-box蛋白(muscle atrophy F-box，MAFbx)和肌肉環(huán)指蛋白-1(muscle ring finger 1，MuRF-1)[3]。該實(shí)驗(yàn)建立CT26結(jié)腸腺癌誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠模型，在華蟾素片干預(yù)與否下，檢測和對比凈體質(zhì)量、心肌、腓腸肌和附睪脂肪的質(zhì)量、腓腸肌組織中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表達(dá)[4]，來探討華蟾素片對惡性腫瘤惡病質(zhì)引起的骨骼肌萎縮的治療價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立

清潔級雄性健康小鼠24只，6～8周齡，體重18～22 g。小鼠CT26腺癌細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)媒介（10%小牛血清、1%青霉素、100μg/mL鏈霉素組成）培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，3代后收集，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗（PBS），制成含腫瘤細(xì)胞的混懸液。將5×106(0.2 mL PBS)個(gè)細(xì)胞接種于16只小鼠前腋窩皮下。

1.2 藥物、試劑與儀器

華蟾素片（國藥準(zhǔn)字Z34020272）。MAFbx(AB3353，1 mg/mL)，MuRf-1(RS1328R，1 mg/mL)；Trizol試劑盒(LGTZ001）。RT-PCR試劑盒(No.121256)。儀器：2720 PCR擴(kuò)增儀；蛋白電泳儀，DYCZ-26B。

1.3 動(dòng)物模型建立、分組與給藥

24只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：正常組（NN）、單純惡病質(zhì)組（CC）、實(shí)驗(yàn)組（EG），每組8只。待動(dòng)物模型建立成功后，實(shí)驗(yàn)組予以藥物干預(yù)：華蟾素片3 g/L溶于生理鹽水中，每只實(shí)驗(yàn)組小鼠灌喂量為0.1 mL/g，正常組及單純惡病質(zhì)組灌喂等量生理鹽水，2次/d，連續(xù)灌喂14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察小鼠進(jìn)入惡病質(zhì)狀態(tài)的表征，實(shí)驗(yàn)前后記錄每只小鼠的凈體質(zhì)量（總體質(zhì)量減去腫瘤質(zhì)量），檢測實(shí)驗(yàn)后每只小鼠心臟、腓腸肌、附睪脂肪的質(zhì)量。RTPCR法檢測MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)：Trizol法提取小鼠腓腸肌RNA；采用β-actin基因，經(jīng)數(shù)據(jù)庫獲得基因序列，采用Primer-Expression軟件輔助設(shè)計(jì)[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凈體質(zhì)量變化及心肌、骨骼肌、附睪脂肪比較

實(shí)驗(yàn)前后的凈體質(zhì)量對比,單純惡病質(zhì)組與實(shí)驗(yàn)組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.394、2.832，P＜0.05)；兩組對比，單純惡病質(zhì)組小鼠凈體質(zhì)量的下降更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.055，P＜0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠凈體質(zhì)量比較[（±s），g]

表1 兩組小鼠凈體質(zhì)量比較[（±s），g]

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實(shí)驗(yàn)后骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質(zhì)量的對比，惡病質(zhì)組小鼠的下降更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質(zhì)量的比較[（±s），g]

表2 兩組小鼠骨骼肌、心肌及附睪脂肪的質(zhì)量的比較[（±s），g]

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2.2 腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)

與正常組比較，單純惡病質(zhì)組、實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但與單純惡病質(zhì)組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠腓腸肌中MAFbx、MuRF-1 mRNA的表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)比較[（±s），g]

表3 兩組小鼠腓腸肌組織MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)比較[（±s），g]

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3 討論

惡性腫瘤已成為威脅全人類生命及健康的最重要疾病之一。到2035年，罹患惡性腫瘤的人數(shù)將增至2 400萬，將成為全球最大的公共衛(wèi)生問題[6]。惡性腫瘤發(fā)展到中晚期，常伴發(fā)腫瘤誘導(dǎo)的惡病質(zhì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有50%的晚期和約80%的終末期患者會出現(xiàn)該癥狀，約22%的癌癥患者的直接死因是惡病質(zhì)，而不是腫瘤本身[7]。國際惡病質(zhì)大會對此達(dá)成了共識：它是多種因素介導(dǎo)的機(jī)體骨骼肌質(zhì)量持續(xù)性下降，伴或不伴有脂肪質(zhì)量的下降，并因此導(dǎo)致多器官功能障礙直至衰竭的臨床綜合征[8]。

經(jīng)過近些年的研究認(rèn)為，癌性惡病質(zhì)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量與體重的下降，有至少3條獨(dú)立的途徑：①溶酶體蛋白酶系統(tǒng)途徑；②鈣依賴的蛋白酶系統(tǒng)途徑；③ATP-泛素-蛋白酶體途徑。其中，泛素-蛋白酶體降解途徑（UPP途徑）是其重要途徑，它由泛素(Ub)、泛素相關(guān)酶（活化酶E1、耦聯(lián)酶E2、蛋白連接酶E3）和蛋白酶體三部分組成。泛素蛋白連接酶E3是途徑激活的關(guān)鍵酶，經(jīng)過催化形成降解信號，使蛋白酶體識別靶蛋白，產(chǎn)生骨骼肌降解。并且它決定了該途徑的特異性和降解速率[9]。MAFbx、MuRF-l是蛋白連接酶E3的重要組分，特異性表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞。在肌萎縮的發(fā)生發(fā)展過程中被顯著激活，使底物蛋白泛素化，加速肌蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)后在蛋白酶體中降解，產(chǎn)生進(jìn)行性的肌萎縮。在該基因去除的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，肌肉萎縮的發(fā)生率下降。因此，MAFbx和MuRF-l基因被認(rèn)為可能是控制骨骼肌蛋白分解的正調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因[10]。

近年來，中醫(yī)藥在治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中均取得重大的進(jìn)展。中醫(yī)認(rèn)為癌性惡病質(zhì)系因癌腫久病，從而耗傷人體的陰、陽、氣、血所致，中醫(yī)藥治療可以達(dá)到清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的作用。尤其在中晚期惡性腫瘤的治療中，起到了增效減毒、提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤生長、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量的作用[11]。華蟾素是由中華大蟾蜍的皮，經(jīng)多道工序制成的口服中成藥，它的有效生物活性成分為吲哚生物堿和甾體強(qiáng)心苷等[12]。該成分可提高樹突狀細(xì)胞表面分子的表達(dá)水平，影響IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，因而增強(qiáng)其抗原呈遞功能，抑制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高免疫力，減緩癌性惡病質(zhì)的進(jìn)展，因而華蟾素被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床輔助治療[13-14]。

在臨床中，謝明智等[15]發(fā)現(xiàn)華蟾素在肝癌引起的癌性惡病質(zhì)的治療中，可明顯改善患者的營養(yǎng)狀況。為進(jìn)一步論證華蟾素在大腸癌惡病質(zhì)治療中效果，該實(shí)驗(yàn)通過建立癌性惡病質(zhì)的動(dòng)物模型，在華蟾素片的灌喂干預(yù)下，實(shí)驗(yàn)組小鼠質(zhì)量由（19.98±1.08）g下降至（18.86±0.63）g，而單純惡病質(zhì)組小鼠的體重由（20.10±1.21）g下降至（17.39±0.75）g，盡管兩組小鼠質(zhì)量均顯著下降(t=5.394、2.832，P＜0.05)。但兩組比較發(fā)現(xiàn)，單純惡病質(zhì)組小鼠凈體質(zhì)量的下降更加明顯(t=4.055，P＜0.05)。為了更加確切地辨別骨骼肌組織的變化，統(tǒng)計(jì)了實(shí)驗(yàn)后心肌組織的質(zhì)量分別為單純惡病質(zhì)組（113.08±12.23）mg、實(shí)驗(yàn)組（133.04±11.57）mg；腓腸肌組織的質(zhì)量分別為單性惡病質(zhì)組（228.84±16.22）mg、實(shí)驗(yàn)組（248.12±10.93）mg；附睪脂肪組織的質(zhì)量分別為單純惡病質(zhì)組（425.90±17.25）mg、實(shí)驗(yàn)組（462.67±28.38）mg，三類指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)，在華蟾素的干預(yù)下，小鼠機(jī)體中重要肌肉組織的萎縮明顯改善(t=3.352、2.788、3.131，P＜0.05)。同樣，在實(shí)驗(yàn)后的腓腸肌組織中MAFbx、MuRF-1 mRNA表達(dá)的對比中可以得到相同的結(jié)論，華蟾素能明顯緩解和改善大腸癌癌性惡病質(zhì)小鼠的骨骼肌和重要臟器的肌肉萎縮程度，為進(jìn)一步的臨床實(shí)踐提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。