豬等孢球蟲純種株的建立及其生物學(xué)特性研究

程振揚(yáng) 臧傳佼 徐向東 李文靜 候照峰 劉丹丹 許金俊 陶建平

摘要 從哺乳仔豬的腹瀉糞樣中分離出等孢球蟲卵囊，感染仔豬建立球蟲純種株。通過(guò)卵囊形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察與18S rRNA PCR鑒定，鑒定該球蟲分離株為豬等孢球蟲。將6只24日齡斷奶仔豬分為2組，分別感染4×102和104個(gè)孢子化卵囊，觀察仔豬的臨床表現(xiàn)及蟲株的潛伏期、顯露期和卵囊產(chǎn)量。結(jié)果表明，感染4×102個(gè)卵囊后仔豬未出現(xiàn)腹瀉癥狀，感染104個(gè)卵囊后仔豬出現(xiàn)腹瀉且持續(xù)6 d。感染4×102個(gè)孢子化卵囊時(shí)，潛隱期為5 d，顯露期為7 d，每個(gè)卵囊產(chǎn)出5.72×103個(gè)卵囊;感染104個(gè)孢子化卵囊時(shí)，潛隱期為5 d，顯露期18 d，每個(gè)卵囊產(chǎn)出6.41×102個(gè)卵囊。由此可見，該株豬等孢球蟲對(duì)仔豬具有致病性，可用于構(gòu)建豬等孢球蟲病動(dòng)物模型及其疾病學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 仔豬;豬等孢球蟲;純種株;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S852.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0095-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment of Pure Strains of Isospora suis and Their Biological Characteristics Research

CHENG Zhen-yang， ZANG Chuan-jiao， XU Xiang-dong et al

（College of Veterinary Medicine / Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract Oocysts of Isospora spp. were isolated from the feces of suckling piglets with diarrhea to infect piglet. A pure strain of Isospora spp.was established. Through the morphological observation of oocysts and PCR identification of 18S rRNA， the isolated strain was identified as Isospora suis.Six 24-day-old weaned piglets were divided into two groups randomly， and infected with 4×102 and 104 sporulated oocysts， respectively.Then the clinical manifestations， the prepatent and patent period， and oocyst output were observed. The results showed that no diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 4×102 oocysts， diarrhea symptom was observed in the piglets infected with 104 oocysts and lasted for 6 days. After the piglets were infected with 4×102 sporulated oocysts，the prepatent and patent period were 5 and 7 days respectively， each oocyst produced 5.72×103 oocysts. After the piglets were infected with 104 oocysts， the prepatent and patent period were 5 and 18 days respectively，and each oocyst produced 6.41×102 oocysts. Therefore， this strain of Isospora suis had pathogenicity to piglets， and it could be used to establish the animal models of coccidiosis and the study of porcine coccidiosis.

Key words Piglet;Isospora suis;Pure strains;Biological characteristics

豬球蟲病主要是由等孢屬（Isospora）和艾美耳屬（Eimeria）的球蟲寄生于豬消化道引起的一種寄生性原蟲病[1]。據(jù)文獻(xiàn)記載，豬球蟲有16種，其中豬等孢球蟲（Isospora suis）致病力最強(qiáng)，是哺乳期仔豬球蟲病的主要病原，可引起仔豬食欲減少、嚴(yán)重腹瀉、消瘦等，其發(fā)病率高達(dá)80%，呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。目前，該病的防治主要依賴于藥物[5]。在評(píng)價(jià)藥物對(duì)豬球蟲病的防治效果時(shí)，需要利用豬等孢球蟲感染仔豬，建立動(dòng)物感染模型。因此，建立豬等孢球蟲蟲株及豬等孢球蟲病模型是評(píng)價(jià)藥物對(duì)豬球蟲病防治效果的基礎(chǔ)，也是進(jìn)一步開展豬等孢球蟲生物學(xué)、疫苗學(xué)和疾病診斷的基礎(chǔ)。筆者通過(guò)卵囊分離、形態(tài)學(xué)觀察及PCR鑒定，建立了豬等孢球蟲的純種株，并通過(guò)人工感染仔豬試驗(yàn)，研究豬等孢球蟲田間分離株的致病性及其排卵囊規(guī)律等。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

21日齡斷奶仔豬，體重5～7 kg，購(gòu)自揚(yáng)州某養(yǎng)豬場(chǎng)。試驗(yàn)前，仔豬糞便用飽和糖鹽水漂浮法檢查有無(wú)球蟲卵囊，連續(xù)檢查3 d，同時(shí)觀察仔豬的精神狀態(tài)、食欲以及糞便形狀等。選擇體質(zhì)健壯、糞檢球蟲卵囊呈陰性的仔豬用于試驗(yàn)。仔豬飼養(yǎng)在經(jīng)5%氨水和高錳酸鉀消毒2次的豬舍與籠子中，料槽、水槽、集糞盤等用具均用沸水沖洗消毒。仔豬定時(shí)喂食，自由飲水。

1.2 糞樣采集、卵囊分離與培養(yǎng)

揚(yáng)州儀征市某豬場(chǎng)12日齡仔豬發(fā)生腹瀉，取新鮮腹瀉物置于塑料袋，放入低溫保存箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。糞樣采用飽和鹽水漂浮法檢查，球蟲卵囊呈陽(yáng)性者，其全部糞樣加入4～5倍清水及少量乙醚溶液后攪拌均勻，分別經(jīng)60目和260目錦綸篩過(guò)濾，所得濾液經(jīng)3 000 r/min離心8 min，棄上層液，往沉淀物中加入清水后攪拌均勻，3 000 r/min離心8 min，重復(fù)2次。往沉淀物中加入10倍體積的飽和糖鹽水（飽和食鹽水溶液與飽和蔗糖溶液的體積比為1∶1），攪拌均勻后3 000 r/min離心10 min，卵囊漂浮于液面。用膠頭滴管吸取上層漂浮物并置于20倍體積的清水中，3 000 r/min離心8 min，棄上清后加清水，攪拌均勻后再次離心（3 000 r/min，8 min）。重復(fù)3次。將沉淀物放入250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入終濃度2.5%的重鉻酸鉀溶液，攪拌均勻后置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。在培養(yǎng)過(guò)程中每天攪動(dòng)培養(yǎng)液數(shù)次，同時(shí)用顯微鏡觀察球蟲卵囊孢子化情況。當(dāng)90%卵囊完全孢子化時(shí)，收集卵囊置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 純種卵囊的分離與增殖

參照戴亞斌等[6]的方法分離等孢球蟲卵囊，分別感染2頭仔豬，每頭感染100個(gè)孢子化卵囊。感染后第6～12天收集仔豬排出的全部糞便，按“1.2”方法分離卵囊并進(jìn)行孢子化培養(yǎng)。

1.4 球蟲種類的形態(tài)學(xué)鑒定

取孢子化培養(yǎng)后的卵囊液制片，分別在10×40和 10×100倍的正置式生物顯微鏡下仔細(xì)觀察每個(gè)卵囊的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，測(cè)量卵囊和孢子囊的大小，對(duì)照參考文獻(xiàn)和圖譜進(jìn)行種類鑒定[1，7]。

1.5 球蟲種類的PCR鑒定

1.5.1 球蟲卵囊純化與總DNA提取。

參照藏傳佼[2]的方法純化卵囊。將純化的卵囊經(jīng)電動(dòng)組織研磨器破碎后，參照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒操作指南提取卵囊總DNA。

1.5.2 豬等孢球蟲18S rRNA序列的PCR擴(kuò)增。

參照藏傳佼[2 ]設(shè)計(jì)引物，由華大科技有限公司合成，引物序列如下：

18S-F為TGTTTATTAGATACAGAACCAACCCAC，18S-R為CTTTCTATGTCTGGACCTGGTGAG。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：ddH 2O 9.5 μL，18S-F（10 μmol/L）和18S-R（10 μmol/L）各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，DNA模板（135 ng/μL）1.0 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 030 bp。同時(shí)，以剛第弓形蟲（Toxoplasma gondii）速殖子和豬艾美耳球蟲（Eimeria spp.）卵囊的DNA模板為對(duì)照，這2種DNA模板均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.6 人工感染試驗(yàn)

1.6.1 試驗(yàn)分組與感染。

將6只24日齡斷奶仔豬分成A、B 2組，每組3頭。A組為低劑量組，每頭感染4×102個(gè)孢子化卵囊;B組為高劑量組，每頭感染104個(gè)孢子化卵囊。借助于開口器與胃導(dǎo)管，將卵囊一次灌胃。

1.6.2 臨床觀察。

每天觀察3次并記錄仔豬的一般臨床體征，如飲食、精神狀態(tài)、糞便顏色與形狀等。每天清洗籠具、食槽和集糞板，防止繼發(fā)感染。

1.6.3 卵囊檢查。

感染后第4天開始用飽和糖鹽水漂浮法檢查糞便。每隔12 h檢查1次，發(fā)現(xiàn)卵囊后，每天收集仔豬全天排出的糞便，采用麥克馬斯特氏法[8]計(jì)算每克糞便中的卵囊數(shù)（oocyst per gram，OPG），然后計(jì)算出每天排出的卵囊總數(shù)，直至排卵囊結(jié)束，連續(xù)2 d糞檢未見卵囊則試驗(yàn)結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 球蟲卵囊形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

卵囊呈球形或亞球形，囊壁光滑且薄，無(wú)卵膜孔，平均大小為19.3（17.8～24.0）μm×17.6（14.7～21.9）μm。孢子化卵囊有2個(gè)孢子囊，無(wú)極粒與卵囊余體。孢子囊呈橢圓形或圓形，有呈顆粒狀的孢子囊余體，無(wú)斯氏體，平均大小為13.9（10.5～15.9）μm×10.4（7.6～11.8）μm。每個(gè)孢子囊內(nèi)含有4個(gè)子孢子，子孢子呈臘腸形或香蕉形（圖1）。

2.2 純種卵囊分離與增殖結(jié)果

仔豬感染卵囊后第6天采用飽和糖鹽水漂浮法檢查其排出的糞便，發(fā)現(xiàn)少量卵囊。隨后收集至感染后第10天的全部糞便，用“1.2”的方法分離卵囊，培養(yǎng)至孢子化。顯微鏡下觀察收集的孢子化卵囊，可見卵囊大小較為一致，卵囊結(jié)構(gòu)與“2.1”中描述一致，表明豬等孢球蟲純種株成功建立并得以增殖。

2.3 球蟲種類的PCR鑒定結(jié)果

以提取的卵囊DNA為模板，成功擴(kuò)增出1 030 bp左右的條帶，與預(yù)期條帶大小相符。用剛第弓形蟲和豬艾美耳球蟲的DNA模板未擴(kuò)增出條帶（圖2）。PCR鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證此次建立的球蟲純種株為豬等孢球蟲。

2.4 臨床觀察

在整個(gè)試驗(yàn)期間，全部仔豬精神、食欲、飲水均正常。A組（低劑量）仔豬排出的糞便外觀正常（圖3a），B組（高劑量）仔豬在感染后第6天排出灰土色的稀糞（圖3b），至第12天糞便形狀恢復(fù)正常。

2.5 卵囊產(chǎn)量、潛隱期與顯露期

豬等孢球蟲感染仔豬后的潛隱期、顯露期及其排卵囊規(guī)律見圖4。仔豬感染孢子化卵囊后第6天糞檢均可見卵囊，潛隱期為5 d。感染4×102個(gè)卵囊的仔豬第7天產(chǎn)出卵囊數(shù)達(dá)到高峰，每頭豬排出15.2×105個(gè)卵囊;隨后卵囊排出數(shù)迅速減少，第11天糞檢未見卵囊，其顯露期為5 d;每頭豬產(chǎn)出卵囊數(shù)共22.89×105個(gè)，每個(gè)卵囊產(chǎn)出5.72×103個(gè)卵囊。感染104個(gè)卵囊仔豬，感染后第8天排卵囊達(dá)到高峰，每頭豬排出20×105個(gè)卵囊;隨后卵囊排出數(shù)顯著減少，但在第12天和第19天排出卵囊數(shù)又略有增加，第23天糞檢未見卵囊，其顯露期為17 d;每頭豬產(chǎn)出卵囊數(shù)共64.10×105個(gè)，每個(gè)卵囊產(chǎn)出6.41×102個(gè)卵囊。

3 討論

迄今為止，文獻(xiàn)記載的豬球蟲有16種，在分類上隸屬艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳屬和等孢屬，在等孢屬僅有豬等孢球蟲一個(gè)種[1-2]。艾美耳屬球蟲孢子化卵囊有4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊中有2個(gè)子孢子;等孢屬球蟲孢子化卵囊有2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊中有4個(gè)子孢子[1]。因此，依據(jù)孢子化卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)易于鑒別豬等孢球蟲。豬等孢球蟲對(duì)哺乳仔豬有易感性，主要引起仔豬腹瀉。該研究采集腹瀉仔豬的糞便進(jìn)行糞檢，在腹瀉物中可見呈球形或亞球形的卵囊，卵囊孢子化培養(yǎng)后見其含2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊中有4個(gè)子孢子。隨后分離純種卵囊并用其感染仔豬、增殖卵囊，對(duì)增殖后的卵囊進(jìn)行PCR鑒定，進(jìn)一步鑒定該株球蟲為豬等孢球蟲。

豬人工感染試驗(yàn)顯示，該豬等孢球蟲純種株的潛隱期為5 d，顯露期分別為5 d（感染4×102個(gè)卵囊）和17 d（感染104個(gè)卵囊），其顯露期隨感染劑量的增加而顯著延長(zhǎng)。藏傳佼[2]報(bào)道24日齡斷奶仔豬感染 4×102個(gè)孢子化卵囊時(shí)，潛隱期為5 d，顯露期為7 d;感染104個(gè)孢子化卵囊時(shí)，潛隱期為5 d，顯露期達(dá)18 d。劉光輝等[9]報(bào)道3日齡仔豬感染30個(gè)豬等孢球蟲孢子化卵囊的潛隱期為7～9 d，顯露期為15～18 d;感染2 000個(gè)豬等孢球蟲孢子化卵囊的潛隱期為4～6 d，顯露期為7～13 d。究其原因，可能與感染豬的日齡、蟲株以及感染劑量有關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果也顯示，豬排出的卵囊總量隨感染劑量的增加而增加，但每個(gè)卵囊的產(chǎn)卵囊數(shù)則有所下降，這與汪飛燕等[10]的報(bào)道相一致，可能是因“擁擠”效應(yīng)所致。

豬等孢球蟲對(duì)不同日齡的豬均有易感性，3周齡內(nèi)的哺乳仔豬感染后可引發(fā)疾病，主要臨床癥狀為腹瀉，病豬衰弱、脫水、發(fā)育遲緩，成年豬多為帶蟲者[11]。用于該試驗(yàn)的豬是24日齡斷奶仔豬，感染4×102個(gè)卵囊后未出現(xiàn)腹瀉癥狀，感染104個(gè)卵囊后出現(xiàn)腹瀉且持續(xù)6 d，表明該豬等孢球蟲蟲株對(duì)仔豬具有致病性，可用于構(gòu)建豬等孢球蟲病動(dòng)物模型，同時(shí)也暗示保育豬和育肥豬在感染大量豬等孢球蟲時(shí)也會(huì)引發(fā)疾病。筆者發(fā)現(xiàn)哺乳仔豬糞便中含有大量的脂肪，用常規(guī)方法分離與收集豬等孢球蟲卵囊較為困難，而斷奶仔豬糞便中脂肪含量低、且粗纖維含量較高，卵囊分離較容易且孢子化率高。因此，筆者建議在進(jìn)行豬等孢球蟲卵囊傳代增殖時(shí)，可選擇斷奶仔豬作為試驗(yàn)動(dòng)物。

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